结直肠癌肝转移的“幕后黑手”

研究背景

• 结肠癌是全球最普遍和最致命的癌症之一，大约一半的结肠癌患者死于肝功能衰竭和其他与肝转移相关的综合征
• 已有研究表明，结肠癌肝转移来源于原发肿瘤的单个循环肿瘤细胞 （CTC），在肝脏形成新的克隆种群，它们在基因组水平上高度相似，因为它们来源于相同的原始癌细胞。
• 上皮-间充质转化 （EMT） 是癌症转移的关键驱动因素。Transcriptional repressor GATA binding 1 （TRPS1） 是 EMT 通路中的重要调节因子

研究方法

• 患者和样本：
  • 一例男性患者CRC IV期，具有多处转移灶，取了正常组织的原发性肿瘤（4），淋巴转移、肝转移、白细胞和独立的良性腺瘤等样本，n=9。
  • 10例肝转移结肠癌患者，20个组织样本（原发和转移）
• 测序：使用 MDA 方法进行单细胞全基因组扩增，，Agilent SureSelect 50M 外显子捕获试剂盒，在 Hiseq 2000 平台测序。目标每个单细胞测序深度30x
• 数据处理：使用 SOAPsnp 来call SNP，其中单细胞中的SNV需至少在3个单细胞中检测到。

研究结果

• 突变结果：共鉴定到了 117 个体细胞 SNV，对于原发或转移的肿瘤样本，平均每个单细胞有 39.82个突变，对于腺瘤样本，平均每个细胞有 10.01 个突变，每个正常细胞有 0.65 个突变（来自血液和正常结肠）。两个转移灶与原发肿瘤不同区域之间的突变计数差异无统计学意义。

• 对于CRC IV期患者：对该患者的多个样本的单细胞数据，突变结果进行聚类，将所有单细胞分为4组：非肿瘤（结肠和血液）、腺瘤、结肠原发性肿瘤和肝转移、淋巴转移（fig1a）。为了确定不同簇（分组）的遗传特征，作者将具有突变的单个细胞进行聚类（fig1b），基于这种分类，确定了每种组织类型中最特异性的突变。并阐明了该结肠癌病例的克隆进化（fig1c）。大多数突变，包括众所周知的驱动突变，在转移之前已经积累。作者还分析了来自肝脏和淋巴转移的每个单细胞的突变状态，将这些与从原发肿瘤获得的所有其他单细胞进行比较，发现肝转移中 93% 的单细胞可追溯到结肠 1 或结肠 5，同样，来自淋巴转移的大多数单细胞与来自结肠 1 和结肠 5 的细胞显示出相似性（fig1de）。这一结果表明，肝转移主要直接起源于原发肿瘤，而不是通过淋巴系。

• 异质性比较：根据突变状态（突变-野生型-不确定型）比较每对单细胞之间的相似性。两个单细胞的相似性定义如下。（a） 只有当所有突变状态相同或无法确定其中至少一个时，才认为两个单细胞相同 （R = 1）。（b） 如果两个细胞在所有位点中具有不同的突变状态，则 R 值为 -1。（c） 如果突变状态在一个单个细胞中为野生型，而在另一个细胞中为突变型，则认为这对细胞不同 （R = -1）。组织的相似性指数是所有细胞-细胞组合的平均 R 值。结果显示，肝脏和淋巴转移都显示出比原发肿瘤更高水平的异质性，结肠 5 与肝脏和淋巴转移的相似性最大（fig2ab）。

• 对另外10例CRC肝转移患者分析：其中 6 例病例存在多克隆转移，4例是单克隆（fig3ab）

• 单细胞RNAseq分析：我们对 6 例 CRC-LM 患者的原发性 CRC 和匹配的肝转移LM样本进行了单细胞 RNA-seq 分析，分别在原发性 CRC 和相应的肝转移样本中获得了 8 个和 5 个癌症亚组（fig3c，figS9abc）。

• 在重点分析 APC 基因的突变状态时，发现。结肠 3 和结肠 8 中的单细胞以纯合突变细胞和杂合突变细胞为主。相比之下，结肠 1、结肠 5 和两个转移组织在 APC 突变状态方面表现出更大的异质性（fig4），这表明组织迁移可能不仅涉及单个细胞，还涉及一组细胞，包括 APC 野生型和突变型细胞。

• TRPS1基因分析：研究人员创建了野生型和突变型 TRPS1（空载体，Con;野生型，WT;和 R544Q 突变体，MT）的异位表达稳定的 HCT116 和 SW480 细胞系，结果表明，TRPS1-MT 组的转移能力比 TRPS1-WT 组高 2 至 3 倍，比对照组高约 3 至 5 倍（fig5bcd）。随后构建肺和肝转移小鼠模型。注射 TRPS1-MT 细胞的小鼠的存活率明显短于注射 TRPS1-WT 或对照细胞的小鼠（fig5e），且携带 TRPS1-MT 细胞的小鼠在多个器官（包括肺、肝、心脏、胰腺、卵巢和远处淋巴结）发生广泛转移（fig5f）

• 对修饰的 HCT116 和 SW480 细胞进行了批量 RNA 测序：分析显示，HCT116 和 SW480 TRPS1-WT 和 TRPS1-MT 细胞之间共有 172 个差异表达基因 （fig6a），显着富集通路，包括epithelial cell proliferation, epithelial to mesenchymal transition (EMT) in colorectal cancer, regulation of cell adhesion, positive regulation of cell motility and positive regulation of cell migration（fig6b），20 个 EMT 相关基因的功能中，ZEB1、SPARC、CDH1 和 EpCAM 是 TRPS1-WT 和 TRPS1-MT 细胞之间差异表达最显著的基因，与结直肠癌转移有关。

总结

研究通过一例转移性CRC患者多病灶取样进行单细胞外显子测序，发现结直肠癌的淋巴转移和肝转移均起源于原发肿瘤的同一区域。肝转移和淋巴转移的遗传异质性比原发肿瘤更大，这支持了转移可能来自原发肿瘤中的肿瘤细胞群的模型。随后的细胞系、小鼠模型等实验表明，TRPS1 R544Q 突变促进了结直肠癌细胞的运动性和侵袭性。TRPS1 R544Q突变通过激活ZEB1表达来促进上皮-间质转化，从而增强结直肠癌的转移能力。综上所述，这项研究揭示了结直肠癌转移的新机制，并可能为结直肠癌的治疗提供新的靶点。