一个单细胞课题却采用两种不同公司的技术

我们马拉松授课最后一个单元是转录组数据分析，包含了上游的Linux和下游的r，而且还有单细胞相关内容。其中单细胞转录组上游流程最经典就是10x技术，如果是正常的10x技术的单细胞转录组：

正常走cellranger的定量流程即可，代码我已经是多次分享了。参考：

• 10X单细胞转录组原始测序数据的Cell Ranger流程
• 10X的单细胞转录组原始数据也可以在EBI下载
• 一个10x单细胞转录组项目从fastq到细胞亚群
• 一文打通单细胞上游：从软件部署到上游分析
• PRJNA713302这个10x单细胞fastq实战
• 一次曲折且昂贵的单细胞公共数据获取与上游处理
• 只能下载bam文件的10x单细胞转录组项目数据处理
• 不知道10x单细胞转录组样品和fastq文件的对应关系
• 10X单细胞转录组测序数据的 SRA转fastq踩坑那些事
• 10x的单细胞转录组fastq文件的R1和R2不能弄混哦

但是学员在使用我们的教程和代码处理这个：https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa/browse/CRA011974 发现里面的4个样品是成功的但是另外的4个就失败了：

Accession Experiment title BioProject accession
CRX750201 CD276_1 PRJCA018455
CRX750202 CD276_2 PRJCA018455
CRX750203 CD276_3 PRJCA018455
CRX750204 CD276_4 PRJCA018455
CRX750205 ctl1 PRJCA018455
CRX750206 ctl2 PRJCA018455
CRX750207 KO1 PRJCA018455
CRX750208 KO2 PRJCA018455

我们首先下载这些文件：

 ls -lh *gz| cut -d" " -f5-
 
24G 8月  21 15:08 CRR833325_f1.fq.gz
26G 8月  21 15:26 CRR833325_r2.fq.gz
22G 8月  21 18:26 CRR833326_f1.fq.gz
24G 8月  21 18:42 CRR833326_r2.fq.gz
26G 8月  21 17:10 CRR833327_f1.fq.gz
28G 8月  21 17:30 CRR833327_r2.fq.gz
27G 8月  21 18:11 CRR833328_f1.fq.gz
28G 8月  21 17:51 CRR833328_r2.fq.gz

11G 8月  21 16:51 CRR833329_f1.fastq.gz
32G 8月  21 16:43 CRR833329_r2.fastq.gz
11G 8月  21 15:54 CRR833330_f1.fastq.gz
29G 8月  21 15:46 CRR833330_r2.fastq.gz
11G 8月  21 14:51 CRR833331_f1.fastq.gz
29G 8月  21 14:44 CRR833331_r2.fastq.gz
11G 8月  21 16:21 CRR833332_f1.fastq.gz
29G 8月  21 16:14 CRR833332_r2.fastq.gz

很明显的看到上面的4个样品和下面的4个不一样，上面的4个样品的左右两个fq文件大小是差不多的，但是下面的4个样品很明显左边的fq文件远小于右边的fq文件！

1. R1文件（Read 1）：
   • R1文件通常包含细胞条形码（barcode）和独特的分子标识符（UMI）。这些信息用于识别单个细胞和单个分子，从而可以追踪到每个转录本的来源。
   • 细胞条形码允许将来自不同细胞的读段区分开来，而UMI则用于区分来自同一细胞的同一基因的多个读段，这有助于减少测序过程中的假阳性。
2. R2文件（Read 2）：
   • R2文件包含实际的转录组序列信息，即cDNA片段的序列。这些序列用于后续的基因表达量分析和基因结构变异检测。

其中：

• R1和R2文件的内容和规则通常由10x Genomics的实验设计和测序平台决定。例如，R1文件的长度和内容可能会根据条形码和UMI的设计而有所不同。
• R2文件的长度则取决于测序的目标区域（如全长转录本或特定区域）和测序平台的读段长度。

也就是说，r1文件里面是16bp的barcode，还有12个bp的umi，总共是28个bp，但是r2里面可以是100bp或者150bp的碱基序列。这样的话，r2文件肯定是比r1大，但是很多情况下我们的测序仪其实对r1和r2都会无差别的给出来100bp或者150bp的碱基序列，有些时候两个文件大小也是可以相当的，取决于我们是否对r1文件进行了裁剪！

那么，上面的4个样品，是因为没有裁剪吗？就需要读一下上面的 CRA011974 数据集对应的文章了：《ITGB6 modulates resistance to anti-CD276 therapy in head and neck cancer by promoting PF4+ macrophage infiltration》，注意到里面的单细胞技术根本就不是10x，而是国产的新格元：

国产的新格元

我们把另外的4个样品，走一下新格元的流程，发现确实是可以定量成功的！而且也是可以降维聚类分群的，如下所示：

降维聚类分群

当然了，还是可以继续读：《ITGB6 modulates resistance to anti-CD276 therapy in head and neck cancer by promoting PF4+ macrophage infiltration》这个文献，做更多的图！