顶刊方法补充---肿瘤演化与微环境相互作用

作者，Evil Genius

周末了，我们复习一下，高分文章的方法补充，文章在

(1)WES数据分析,如下

1、BWA-mem比对（GRCh38） 2、使用samtools将输出的SAM文件转换为BAM文件 3、使用Picard （v.2.6.26）排序工具对BAM文件进行排序和标记重复项，并使用以下参数：CREATE_INDEX=true, SORT_ORDER=coordinate, VALIDATION_STRINGENCY=STRICT，并将所有其他设置为默认值；和参数REMOVE_ duplduplicate =true的markduplicate 4、使用samtools （v.1.14）索引对最终的BAM文件进行索引。 5、体细胞突变使用Somaticwrapper管道从WES数据中调用，其中包括四个不同的调用程序：Strelka (v.2.9.10), MUTECT (v.1.1.7), VarScan (v.2.3.8)和Pindel (v.0.2.5)。文章保留了MUTECT （v.1.1.7）、VarScan （v.2.3.8）和Strelka （v.2.9.10）中任意两个调用的外显子单核苷酸变体（SNV），以及VarScan （v.2.3.8）、Strelka （v.2.9.10）和Pindel （v.0.2.5）中任意两个调用者调用的插入和缺失（indel）。 6、通过肿瘤中最小的VAF为0.05和正常样本中最大的VAF为0.02来过滤SNV和indels。过滤了在同一肿瘤样本中发现的indel的10bp内的任何SNV。 7、使用Somaticwrapper使用COCOON （https://github.com/ding-lab/COCOONS）将相邻的SNV组合成双核苷酸多态性。

（2）突变映射到snRNA-seq和ST数据

分析方法：scVarScan。该工具可以通过跟踪snRNA-seq和snRNA序列中的细胞和分子条形码信息来识别每个细胞中支持参考等位基因和覆盖变异位点的变异等位基因的reads。工具的链接在https://github.com/ding-lab/10Xmapping，下面是用法

step 1: extracting reads contains the reference allele and variant allele of a somatic variant

perl 10Xmapping.pl --mapq --bam --maf --out

mapq: the mapping quality; Default 0

bam: the scRNA-seq bam path

maf: the maf file containing a list of somatic variants

out: the output file

step 2: get the corresponding table between ref allele, var allele and 10X barcode

perl parse_scrna_bc.pl $fin $fout

fin: the input file from step 1's output

fout: the output file

step 3: output number of reads supporting reference and variant alleles and VAF

perl rc.pl $fin $fout

fin: the input file from step 1's output

fout: the output file

（3）空间突变VAF统计检验

1、每个在ST上所有spot上覆盖大于30个reads的突变,计算所有肿瘤区域spot和所有非肿瘤区域spot的VAF，即所有spot上的变异reads数除以所有spot上的总reads数。 2、使用非肿瘤斑点的VAF作为背景进行二项检验. 3、使用p.adjust（）函数对两组测试进行多次测试校正。

（4）使用WES call CNV.

分析方法：GATK、Bedtools。

（5）空间转录组分析CNV

分析方法： InferCNV 。在样本水平上运行intercnv（scRNA和snRNA），并且仅使用使用原始计数矩阵的后质量控制过滤数据。所有非恶性细胞作为参考，注释为“非肿瘤”，所有恶性细胞都有相同的注释“肿瘤”，参数如下：analysis_mode=“subclusters”，--cluster_by_groups=T，--noisise =T，--HMM=T。对于Visium ST数据，以200个ESTIMATE纯度分数最低的注释为“非恶性”的spot作为参考，“恶性”spot以其微区ID作为注释，参数为：window_length=151, analysis_mode=“sample”，--cluster_by_groups=T，--noisise =T，--HMM=T。CalicoST (https:// github.com/raphael-group/CalicoST) 63在Visium ST数据上运行，具有相同的输入注释（微区ID）。来自同一区域的所有spot被视为最小的分析单位。然后使用默认参数运行CalicoST，并手动检查结果。

关于CalicoST，参考文章在从空间解析转录组学推断等位基因特异性拷贝数畸变和肿瘤系统图谱

（6）拷贝数相似度评分

改进的Jaccard相似性评分，CNV谱被定义为一组基因组窗口，其注释拷贝数为中性(0)、扩增(1)或缺失（−1）。然后比较两个CNV谱，并打破重叠的基因组窗口，使两个谱具有相同的窗口集，将CNV相似度评分（Sim）定义为

（7）单细胞的细胞类型注释，搜集一下marker。

（8）单细胞空间联合分析

使用默认参数和doublet_mode = ' multi '的RCTD对每个点的细胞类型组成进行反卷积。每次运行的参考是从匹配snRNA-seq或Multiome样本的Seurat对象中手动注释的细胞类型。

（9）肿瘤边界空间细胞-细胞相互作用

使用COMMOT和CellChat数据库评估ST样品中基于空间的细胞-细胞相互作用（CCI），距离阈值为1000µm。比较样本上所有肿瘤边界spot（包括肿瘤边界层和TME边界层）和所有非边界spot（Wilcoxon秩和检验）的每个相互作用的配体和受体信号的中位数。信号差大于0.1且FDR小于0.05的相互作用被认为是显著的边界富集。

（10）邻域分析，距离分析（Xenium、CODEX、Visium）。

（11）空间区域注释（morph）

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