“似乎是被低估的一篇文章呢~
我们来看看产出这篇文章，作者需要如何谋划和布局，这样的流程是值得我们去学习的：
文章的核心分析思路是这两句话：
“Firstly, we performed a two-step MR to identify traits influenced by childhood body size that have a causal effect on breast cancer. Subsequently, traits were assessed in a multivariable MR analysis to assess the magnitude of their direct effect on breast cancer risk, followed by a mediation analysis to quantify the indirect effect.
——两步法和多变量MR！！！
两步法的实现
对于每个中介因子，我们都进行了两步MR分析，其中每一步都是独立的单变量双样本MR分析（图 ii）。
在第 1 步中，将body size作为暴露因子，将中介作为结果；
在第 2 步中，将中介因子作为暴露因子，将breast cancer作为结果。
多变量MR
我们依次对body size和每个中介因子与乳腺癌风险的关系进行了 MVMR 分析（图 iii）。
结果如下：
这样一来，我们就可以在考虑每个中介因子后，确定童年体型对乳腺癌风险的直接影响。
MVMR 仅针对那些在 MR 两步法中至少有一步显示出效应证据，且两步法的敏感分析均显示出一致结果的中介因子进行（见灵敏度分析和先验性分析）。
从图中可以看到，与单变量 MR 得出的童年体型对乳腺癌的总效应 OR 相比，童年体型的直接效应 OR 介于初潮年龄和总睾酮之间。这表明在考虑了每个潜在的中介因素后，童年体型对乳腺癌的影响没有实质性变化。
我们还将成人体型和儿童身高作为 MVMR 的第三个暴露因子（除儿童体型和中介因子外），分别进行了两次分析。同样，在有额外暴露的情况下，童年体型的直接影响没有发生实质性变化
敏感性分析
为了研究可能违反 MR 假设的情况并验证 IVW 方法得出的双样本 MR 结果的稳健性，我们使用 MR-Egger方法和加权中位数方法进行了额外的 MR 分析，这两种方法对多效性都比较稳健。
此外，Egger 截距用于探索是否存在潜在的方向性水平多效性，而 Cochran 的 Q 统计量则用于量化 SNP 之间的异质性程度，这表明存在潜在的多效性。
MVMR 的敏感分析包括工具强度和水平多向性测试。敏感分析的结果被用作将中介因子纳入下游分析的选择工具。
最后，对于hormone性状中存在的违反两步法MR 要求的问题（两步法 MR 的第 1 步），即“赢家诅咒”，我们采用了拆分样本的方法来解决。该分析结果与全样本分析结果一致。
“拆分样本的方法： 双样本 MR 分析的一个重要要求是暴露和结果 GWAS 是两个不重叠的数据集，这比单样本 MR 分析中的赢家诅咒和反保守弱工具偏差(winner’s curse and anti-conservative weak instrument bias)等局限性更有优势。 “在有关童年体型对激素和某些生殖特征影响的双样本 MR 分析中，这一要求没有得到满足，因为中介GWAS分析是在与主要暴露（童年体型）相同的队列（即英国生物库）中进行的。 为了克服这种偏差并评估结果受影响的程度，我们采用分离样本的方法重复了 MR 分析。 “这是因为英国生物银行的样本量很大：数据被随机分成两部分，一部分用于对暴露（儿童体型）进行新的GWAS分析，另一部分用于对结果（激素/生殖特征）进行新的GWAS分析。从新的分离样本暴露 GWAS 中提取暴露工具（p <5×10-8），重复两步 MR 和 MVMR 的第一步。 “最后，有两个独立样本的要求并不适用于 MVMR 中使用的暴露，即在分析中使用英国生物银行的暴露和介导因子都是可以接受的。
中介分析
接下来，我们进行了一项中介分析，利用两步 MR、MVMR 和总效应的效应估计值（i，补充数据 6），通过选定的中介因子来估计童年体型对乳腺癌风险的间接效应。该分析仅限于在 MVMR 中显示出效应证据且具有较强工具变量强度的中介因子。
通过模拟分析比较现有的中介分析方法，以相当高的置信度选择了Product method作为主要中介分析方法，并以 Delta method作为相应的 SE/CI 估算技术。
间接效应的结果：
间接效应的估计是暴露对中介效应的总效应系数（两步MR的第一步）与中介效应对结局的直接效应系数（MVMR）的乘积，即Product法，95% CI是根据Delta法估计的SE计算的。
补充材料一览：
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