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根据线粒体基因进行过滤

生信技能树jimmy

发布于 2024-05-01 06:23:15

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前情提要

上篇推文中对ncount_RNA 和nFeature_RNA进行了可视化，然后基于可视化结果进行了阈值的判断，并且也给大家分享了在实际分析中的应用

其中也提到了在我们的质控脚本中，首先是计算了线粒体、核糖体以及血红细胞的比例，然后就可视化了细胞中这些参数的情况，在基于这些数据进行一个过滤

那这期我们来了解一下如何根据线粒体、核糖体以及红血蛋白基因的比例，对细胞进行过滤

为什么要基于这些基因进行过滤

单细胞中表达量最高的基因一般是线粒体基因、核糖体基因等

#抽样查看TOP50基因
# 这里的C 这个矩阵，有一点大，可以考虑随抽样 
C=subset(sce.all,downsample=1000)@assays$RNA$counts
dim(C)
dim(sce.all)

C=Matrix::t(Matrix::t(C)/Matrix::colSums(C)) * 100

most_expressed <- order(apply(C, 1, median), decreasing = T)[50:1]

pdf("TOP50_most_expressed_gene.pdf",width=14)

pdf("test.pdf",width = 15,height = 15)

boxplot(as.matrix(Matrix::t(C[most_expressed, ])),
        cex = 0.2, las = 2, 
        ylim=c(0,8),
        xlab = "% total count per cell",
        col = (scales::hue_pal())(50)[50:1], 
        horizontal = TRUE)


dev.off()

如果是线粒体基因高表达的细胞，可能是处于凋亡状态或者裂解状态的细胞，会干扰后续的分析

红细胞中会高表达血红蛋白基因，而红细胞本身是不含有细胞核的，且携带的基因少，其携带的基因与疾病以及生物发育等过程没有太大的联系，所以可以直接剔除掉

计算基因比例

在读取完数据创建seurat对象之后，会为每个细胞创建一个元数据，保存在meta.data里面，比如我们上次介绍的nFeature_RNA和nCount_RNA，统计一下全部基因的表达量

但是并不会计算线粒体、核糖体这些单独的基因的比例，所以需要我们自行计算一下这些基因，然后也保存在meta.data里面

计算方法：

根据基因名特征进行整理
使用PercentageFeatureSet进行计算

#计算线粒体基因比例
mito_genes=rownames(sce.all)[grep("^MT-", rownames(sce.all),ignore.case = T)] 
print(mito_genes)
sce.all=PercentageFeatureSet(sce.all, features = mito_genes, col.name = "percent_mito")
fivenum(sce.all@meta.data$percent_mito)

#计算核糖体基因比例
ribo_genes=rownames(sce.all)[grep("^Rp[sl]", rownames(sce.all),ignore.case = T)]
print(ribo_genes)
sce.all=PercentageFeatureSet(sce.all,  features = ribo_genes, col.name = "percent_ribo")
fivenum(sce.all@meta.data$percent_ribo)

#计算红血细胞基因比例
Hb_genes=rownames(sce.all)[grep("^Hb[^(p)]", rownames(sce.all),ignore.case = T)]
print(Hb_genes)
sce.all=PercentageFeatureSet(sce.all,  features = Hb_genes,col.name = "percent_hb")
fivenum(sce.all@meta.data$percent_hb)

人类和小鼠的线粒体核糖体基因区别：

人类的核糖体基因是RPS/RPL开头
人类的线粒体基因是MT-开头
小鼠的核糖体基因是Rps/Rpl开头
小鼠的线粒体基因是mt-开头

可视化

feats <- c("percent_mito", "percent_ribo", "percent_hb")1
p2=VlnPlot(sce.all, group.by = "orig.ident", features = feats, pt.size = 0, ncol = 3, same.y.lims=T) + 
  scale_y_continuous(breaks=seq(0, 100, 5)) +
  NoLegend()
p2

如果分析中发现某些单细胞样品中的线粒体表达量特别高，可能说明这个样品质量是比较一般的

设置阈值过滤

一般简单的过滤就是基于可视化的结果，设置一个上限

#过滤指标2:线粒体/核糖体基因比例(根据上面的violin图)
selected_mito <- WhichCells(sce.all, expression = percent_mito < 25)
#selected_ribo <- WhichCells(sce.all, expression = percent_ribo > 3)
selected_hb <- WhichCells(sce.all, expression = percent_hb < 1 )
length(selected_hb)
length(selected_ribo)
length(selected_mito)

sce.all_filt <- subset(sce.all, cells = selected_mito)
#sce.all <- subset(sce.all, cells = selected_ribo)
sce.all_filt <- subset(sce.all_filt, cells = selected_hb)
dim(sce.all_filt)

table(sce.all_filt$orig.ident)

根据线粒体核糖体基因进行过滤

在过滤线粒体核糖体基因推文中提到了过滤的方式

1. 粗暴的去除全部线粒体基因

直接在表达矩阵里面，去除掉属于的那一行表达量即可

2. 设定阈值去除掉高表达量细胞

多次反复查看线粒体核糖体基因的影响，分群前后看，不同batch看，多次质控图表里面显示它，判断它是否是一个主要因素

3. 高表达核糖体基因的细胞是否要去除

在不影响分群和功能分析时可以不删除，很多细胞里都大量表达核糖体基因，如果一刀切全删除，会删除很多目的细胞。

在分析中的应用

与ncount_RNA 和nFeature_RNA一样，在进行单细胞亚群可视化的时候，也会可视化一下线粒体核糖体基因这些基因的比例

  feats <- c("percent_mito", "percent_ribo", "percent_hb")
  p2=VlnPlot(sce.all.int,  features = feats, pt.size = 0, ncol = 3, same.y.lims=T) + 
    scale_y_continuous(breaks=seq(0, 100, 5)) +
    NoLegend()