单细胞分析揭示协同作用的肿瘤微环境动态有助于确定胰腺癌的亚型

文章概述

基本信息

文章标题：Coordinated single-cell tumor microenvironment dynamics reinforce pancreatic cancer subtype 发表时间：2023-08 发表杂志：Nature Communications 影响因子：16.6 在线阅读链接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-40895-6

文章摘要

背景：胰腺导管腺癌 （PDAC） 样本的bulk RNA 分析因肿瘤微环境 （TME:即来自成纤维细胞、内分泌、外分泌和免疫细胞的信号） 而变得复杂。虽然已经建立了具有预后意义的肿瘤和基质亚型，但对驱动不同免疫和基质图谱的潜在信号的理解仍然不完整。

方法和结果：整合了来自七项独立研究的 92 个单细胞 RNA-seq 样本，以构建可重现的 PDAC 图谱，重点关注肿瘤-TME 的相互依赖性。活化基质（activated stroma）患者有着较高的肌成纤维细胞和免疫原性成纤维细胞，并且进一步显示 M2 样巨噬细胞和调节性 T 细胞增加。相比之下，具有“正常”基质的患者表现出 M1 样募集、效应器升高和 T 细胞耗竭。为了帮助未来研究的互操作性，文中提供了一个预训练的细胞类型分类器和一个基于亚型的信号因子图谱，也在小鼠数据中验证了这些因子。

结论：这项工作利用单细胞研究之间的异质性来创建了控制PDAC信号转导相互作用的综合视图。

疾病简介与实验设计

疾病简介

胰腺导管腺癌 （PDAC） 是癌症死亡的主要原因之一，5 年生存率仅为 10%。只有四分之一的PDAC患者被早期诊断为完全手术切除，对于大多数患者来说，化疗最终成为唯一的选择。PDAC肿瘤的分子分析通常受到肿瘤细胞有限以及与内分泌、外分泌和免疫细胞混合的大量基质的存在而被阻碍。为了更好地研究PDAC肿瘤细胞，已经使用了激光捕获显微切割、类器官和异种移植物等替代方法。作者之前对大量RNA-seq样品进行了虚拟显微切割，确定了“基底样”和“经典”肿瘤亚型的预后基因特征，强调了PDAC患者癌症内在异质性的重要性。此外，作者描述了“正常”和“激活”的基质亚型，后者的结果更差。诸如此类的基因特征在支持治疗决策的初步试验中非常重要。

近年来，肿瘤微环境（TME）在寻找替代治疗方式方面引起了极大的兴趣。微流控和单细胞RNA测序（scRNA-seq）的进步使得在单个细胞水平上对癌症TME进行高通量和高分辨率分析成为可能。这使作者能够研究肿瘤异质性，同时克服盲源分离的挑战。几项对胰腺组织的单细胞研究有助于揭示以前未解决的生物学和疾病过程。例如，发现了新的祖细胞样导管细胞，它们分化为成熟的导管、腺泡或胰岛细胞。癌症相关成纤维细胞 （CAF），包括肌成纤维细胞 CAF （myCAF）、免疫原性 CAF （iCAF） 和抗原呈递 CAF （apCAF） 被证明在细胞外基质产生、免疫抑制、脉管系统重塑、肿瘤增殖和转移中发挥作用。具体来说，这些TME表型在一定程度上是通过激活或抑制转录程序的信号配体来促进的。例如，肿瘤来源的白细胞介素-1 （IL-1） 通过 JAK/STAT 信号转导诱导胰腺星状细胞 （PSC） 中由 LIF、IL6 和 G-CSF 组成的细胞因子级联反应形成 iCAF 群体。此外，巨噬细胞和淋巴细胞的亚群已被描述在多种肿瘤类型中，增加了表型多样性和转录异质性，最终导致TME 可塑性。

随着许多新的注释细胞类型，重点已转向揭示细胞信号转导机制和特征网络如何在PDAC患者中共同形成异质性肿瘤。然而，从不同实验室获得的细胞类型比例之间存在明显差异。因此，这些新型细胞类型和肿瘤生态系统中可能存在的独特信号转导机制的可重复性和患者总体生存率尚未得到充分探索。

在这项工作中，作者利用公开可用的数据集来克服单个分析的收集和技术偏差，并创建PDAC的TME单细胞图谱。作者证明了基质和肿瘤亚型之间的密切关系，这与多个细胞区室的不同信号传导模式相关。进一步强调了可能驱动这些不同组织表型的亚型依赖性细胞信号相互作用，希望靶向这些相互作用可能会导致新的治疗方法。

实验设计

文中共使用了7个数据集：

分析所用的数据集（图 S1c）

数据集具体的项目编号如下：

• Peng: CRA001160(GSA)
• Powers: GSE231535
• Qadir: GSE131886
• Segerstolpe: EMTAB-5061
• Lin: GSE154778
• Moncada: GSE111672
• Muraro: GSE85241

从图 S1a中可以看到发现数据集由四个数据集整合：Peng；Powers；Qadir；Segerstolpe。验证数据集由三个数据集整合：Lin；Moncada；Muraro。

结果

单细胞PDAC的综合meta分析提供了丰富而详细的TME图谱

使用 Seurat 流程处理本地和公共数据集整合的正常和 PDAC 衍生患者的综合胰腺 scRNA-seq 数据集（图 1a、S 1a、b）。跨数据集的患者贡献了独特的细胞类型亚群组成，这些亚群反映在初始研究目标、患者临床状况和可变组织处理中，使作者能够观察到一组更全面的细胞类型（补充数据 1）。图谱的 UMAP 显示了细胞在患者和独立数据集之间的成功整合（图 1b、S1c），并提供了来自 PDAC 组织活检的丰富组成和表型信息。可视化典型标记物可识别主要细胞类型（图1c）。这些细胞类型被进一步细化为不同的亚群，以便进行更深入的分析（图1d，S 1b）。这些细胞类型还被验证为与原始研究中先前建立的标记一致。

图 1a-d

图 S1a-b

成纤维细胞基质：结缔组织增生性 PDAC TME 通常表现为活化的 CAF 和星状细胞群的增加。先前的研究已经描述了肌成纤维细胞 CAF （myCAF）、补体分泌 CAF （csCAF） 和免疫原性 CAF （iCAF） 之间的差异表达分析（图 S1d）。另外两个先前描述的胰腺星状细胞 （PSC） 相关亚群分为平滑肌 （smPSC） 和静止 （qPSC）。观察到少量IL11+ CAFs、雪旺细胞和肌细胞，但并非在所有患者中都存在，并且被排除在差异基因表达分析之外。

髓系/巨噬细胞：检测 2 种主要树突状细胞 （DC） 群体和几种髓系活化状态。（图 S1e）。两个树突状细胞群包括募集 LAMP3 + DC 的调节性 T 细胞 （T-Reg） 和单核细胞衍生的常规 CD1C+ DC （mo-DC）。常驻巨噬细胞显示补体相关表达，与先前的发现一致。经典激活的单核细胞通过 S100A8 表达进行鉴定。观察到 3 个肿瘤相关巨噬细胞 （TAM） 群体，包括先前鉴定的表达 MIF 的 SPP1 + TAM，这与选择性激活有关。SPP1+ TAMs有最高的CXCL8表达，这在浸润性肿瘤前沿已有报道。M2 样 TAM 亚群似乎是单核细胞来源的 （APOC1+）并表达颗粒蛋白 （GRN），这有助于 PDAC 中 CD8+ T 细胞的排斥。

内皮细胞：内皮细胞（EC）在PDAC和正常来源的胰腺组织中都很丰富。根据先前的单细胞研究确定了 3 个主要细胞亚组，例如、毛细血管“尖端状”EC 、静脉EC 和动脉EC（图S1f）。鉴定了一个表达抗血管生成标志物（JAK/STAT 抑制 - SOCS3 和 SPRY1）的“调节性”内皮亚群。

淋巴细胞：观察到肿瘤杀伤和肿瘤允许淋巴细胞的动态图谱，在其他实体恶性肿瘤中类似。共同鉴定了B淋巴细胞，CD4 + / CD8 + T淋巴细胞和过渡性群体，例如祖淋巴细胞和增殖淋巴细胞（图S1g）。CD4+ T 细胞包括表达 TIGIT 的 LEF1+ Naive-CD4 和 CTLA4+ T-Regs。CD8阳性在早期功能失调前TSC22D3+ 、功能失调的LAG3+肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）增加，但在NKG7+细胞毒性效应CD8 群体中降低。B淋巴细胞群由未成熟（TCL1A+）、成熟记忆B细胞和浆细胞（MZB1+）组成。补充数据 1 中提供了区室特异性基因表达的完整列表。

分泌组的交叉TME分析突出了关键的信号转导轴和标志物

作者使用统计标准（最小细胞表达>20%的细胞，组间表达差异>10%），调查了上述细胞类型（图1e）中所有已知为分泌配体和受体的差异表达转录本。

值得注意的发现包括 qPSC 中T细胞募集的 CCL21 表达、iCAF 中的 IL6 表达和 myCAF 中的 INHBA表达。CXCL12 是另一种趋化因子，在免疫原性 CAF 和静脉 EC 中表达。相应的受体CXCR4在早期（预激活）CD8+ T细胞和记忆B细胞中表达最高。动脉、毛细血管和静脉内皮亚群显示血管生成和有丝分裂因子（即 VEGF、INSR）和免疫调节因子（如 LIFR、CX3CL1 和 CCL23）的上调。单核细胞来源的 DC 表达 CSF2R，CSF2R 是 csCAF 和 myCAF 分泌的 CSF2 受体 （GM-CSF）。SPP1+ 巨噬细胞表达 MRC1（M2 标志物）和 TREM2，与肿瘤浸润 CD8 耗竭相关。LAMP3+ DC 的 LGALS9 （半乳糖凝集素-9） 表达最高，其促进表达 TIM-3 （HAVCR2）的巨噬细胞的 M2 极化。最后，作者建立了一个标记物的pan-TME panel，作为稳定表达的生物标志物的资源，可以使用正交技术识别细胞类型（补充数据2，图S1i）。

用于人类和小鼠数据的自动单细胞分类器

为了自动对胰腺癌单细胞数据进行基本细胞类型注释，作者使用发现数据集的单细胞网络训练了一个多类随机森林分类器（图2a）。针对内部的 99,518 个单元验证集进行测试，文中实现了 96.4% 的模型准确率和 98% 的 AUPRC。另一方面，作者使用来自三项独立研究的验证数据集训练了第二个随机森林模型（图2b）。最后，两种模型在研究中的交叉验证表明，两个模型内的高的标签一致性（验证率：92.6%，训练率：95.8%）和高的注释的概率（图2c）。为了与人类和小鼠PDAC实验模型兼容，文中仅使用共同特征（同源转录本）进行分类，从而可以识别两个物种中的广泛细胞类型（图2d，e）。

正常和激活的基质特征反映了两个不同 CAF 群体之间的患者水平梯度

作者试图更好地将先前建立的亚型与PDAC的最新单细胞注释进行匹配。作者注意到“激活”成纤维细胞特征表达在 myCAF、“反应性”基质和经典 CAF （cCAF）中的广泛重叠（图 3a、S2a）。对免疫原性亚群的仔细检查显示，iCAFs和最近描述的csCAFs确实是具有重叠特征的不同组（图3b）。apCAF相关CD74表达的定位在雪旺细胞中似乎最高（图S2b），但未发现代表apCAF的分离细胞组。基质的其余细胞代表具有 CAF1/CAF2 特征的 2 个 PSC 组 （图 3c）。

此外，两种基质亚型特征的 pseudobulk 表达热图显示从正常基质到逐渐升高的活化状态的梯度。一致性聚类将患者分为正常或活化基质，以及混合中间组（Fig. 3d，S 2c，d）。基质亚型特征评分突出了 myCAF 中激活表型的富集，而在 PSC 中发现了正常特征（图 3e）。

PDAC TME的细胞组成与基质亚型相关

基于 CAF 和 PSC 亚群中亚型特征的不同富集，作者假设基于基质亚型的差异信号转导最终导致不同的 TME 组成和致瘤表型（图 3f-h）。作者观察到主要活化基质表型的患者在基质内具有较高百分比的 myCAF 和 csCAF，而正常亚型患者具有较高的 PSC。髓系区室的类似比较显示更高的 SPP1+ 和 GRN+ TAM、驻留巨噬细胞和具有活化基质的 mo-DC，而经典活化的单核细胞和杀瘤巨噬细胞（M1 样，CIBERSORT）在正常亚型中更高。活化队列的淋巴细胞显示出更高比例的 CD4+ T-Regs，以及更高的 T 细胞特征评分，而正常患者的整体 T 细胞更高，CD8+ T（细胞毒性和功能失调）、幼稚 CD4+ T 细胞百分比和效应相关特征评分增加。

图 3f-h

TME 信号转导控制由基质亚型区分的抗肿瘤和促肿瘤表型

在激活的亚型中，myCAFs 的表达与分泌的 INHBA 一致，后者参与上皮细胞中的 SMAD2/SMAD3 通路。此外，癌症进展和化疗耐药相关的OXT/OXTR（催产素）基因在CAFs和肿瘤细胞之间高表达。肌成纤维细胞 CAF （myCAFs） 和内皮 TGFBR1 被确定为基底样肿瘤细胞 TGFB2 的潜在靶标。IL19 诱导的促纤维化 STAT3 通路在激活的 myCAF 中由 IL20RA 显示。免疫检查点分子 PDCD1LG2 （PDL2）和 TNFSF4 （OX40L）在 myCAF 中表达，而 CD8+ T 细胞和 T-Regs 分别表达匹配的受体对 （PD1 和 OX40）。活化的 TME 的髓样细胞描绘了 M2 极化，其特征是 GRN+ TAM 中 CD209 的表达（图 3g）。myCAFs和内皮细胞分别表现出FGF7/FGFR2和VEGFC/FLT4信号的上调，促进细胞迁移和淋巴生长（图3f）。内皮细胞似乎通过激活的TME中的IL1B信号促进趋化性（图S2c），并额外表达巨噬细胞调节基因，包括MIF和MARCO。

基于经验表达数据的这些相互作用的总体模型如图3i，j所示。

肿瘤亚型特征分离PDAC单细胞，并与不同的TME活性相关

从正常来源和PDAC来源的组织聚集的上皮细胞被亚聚类以得到更精细的细胞类型注释，即揭示腺泡、正常导管、炎症性化生（inflammatory metaplastic）和肿瘤亚群。按样本来源（正常或肿瘤）拆分数据显示肿瘤样本中肿瘤和化生的富集（图4a）。UMAP密度图显示了与细胞注释相对应的典型标记基因的清晰定位（图4b）。值得注意的是，KRT17（basal：基础）和TFF3（classical：经典）标志物的表达严格分离到肿瘤簇中。使用 pseudobulk 的上皮分析确定了基础型或经典表型的患者，在某些情况下，在同一患者的组织中检测到了两者，证实了最近的PDAC类器官亚型二分法的工作研究（图4c）。作者使用前 1,000 个可变基因进一步分析肿瘤上皮，并将数据投影到 3D UMAP 空间（图 4d），显示了化生和肿瘤之间的桥梁，可能突出了晚期致瘤分化。在化生簇的边缘也观察到正常的导管细胞，暗示了主要正常导管簇的基本转变（图S3a）。化生簇呈现早期恶性肿瘤标志物，如MMP7 和 MUC6（图S3c）和独特表达的肿瘤抑制基因，这些基因指向针对细胞损伤或突变的稳态机制（图4f）。接下来，作者对肿瘤亚群进行亚集，并对每个单细胞的基础/经典亚型表达进行评分，以表明癌细胞相应地与患者表型匹配，而一些患者同时混合了基础和经典，正如其他人所观察到的那样（图 4g）。“混合”亚型患者的细胞代表了一种中间状态，而不仅仅是两种肿瘤亚型的混合。这种对“混合”肿瘤患者和“中间”亚型的观察结果与最近的组织学研究一致。

基于跨隔室（Cross-compartment-based）的特征在患者之间的相关性

为了探索TME的相互关联性，作者分析了一种细胞类型的存在如何与其他区室中的表型相关联。亚种群比例的相关性分析揭示了两个主要的相关特征模块（图5a，S 4b）。在第一个模块中，正常基质和经典细胞类型丰度均呈正相关。PSC基质比例也与经典上皮比例显著相关，与正常亚型观察结果一致。值得注意的是，该组还与细胞毒性 CD8+ T 细胞和 FSIP2+ TAM 呈正相关。第二个模块将基础特征和活化特征以及 SPP1+ TAM、myCAF、T-Regs 和免疫原性 CAF 的增加组合在一起。

作者进一步扩展了这一分析，从最近的出版物（补充数据3）中收集了代表典型PDAC亚型、通路、免疫调节和代谢特征的基因特征列表（图5b，S 4c）。当观察区室特异性表达特征而不是细胞类型比例时，作者发现“基底样/激活”特征与上皮/内皮TGFB产生增加的证据相关，而TGFB反应特征在基质中升高。此外，还观察到基质内的基质金属蛋白酶特征和骨髓细胞的 IL17 信号传导（图 5b）。其他“经典/正常”TME谱包括经典和正常亚型特征以及髓系和上皮区室中升高的IFNG反应特征。该模块包括腺泡到导管化生、刺猬和视黄醇信号传导的特征。如前所述，代谢比较显示糖酵解特征组与基础模块相关，而氧化磷酸化与经典模块相关。淋巴细胞特征包括跨内皮迁移、肿瘤浸润淋巴细胞和 PD1 信号传导。最后，与阳性化疗反应相关的类器官衍生特征与正常/经典 TME 相关。总的来说，该分析提供了一个相关细胞类型特异性信号转导的联合模型，描述了PDAC中两种截然不同的TME。

小结

• 整合不同数据集的癌症和正常样本（通过harmony整合），能够观察到一组更全面的细胞类型。
• 单细胞PDAC的综合meta分析包括成纤维细胞基质，髓系/巨噬细胞，内皮细胞，淋巴细胞。
• 结合亚型与单细胞特征进行分析，发现活化基质（activated stroma）患者有着较高的肌成纤维细胞和免疫原性成纤维细胞，并且进一步显示 M2 样巨噬细胞和调节性 T 细胞增加。具有“正常”基质的患者表现出 M1 样募集、效应器升高和 T 细胞耗竭。