DAY7- 测序知识

测序知识

1.构建DNA测序文库

把DNA分子用超声波打断成在一定长度范围内的小DNA片段。目前除了一些特殊的需求之外，基本都是打断为300bp-800bp长的序列片段，并在这些小片段的两端添加上接头，构建出单链DNA文库，以备测序之用。

2.测序流动槽（flowcell）

flowcell是用于吸附流动DNA片段的槽道，也是核心的测序反应容器——所有的测序过程就发生在这里。当文库建好后，这些文库中的DNA在通过flowcell时会随机附着在flowcell表面的槽道（称为lane）上。每个lane的表面都附有很多接头，这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对。

3.桥式PCR扩增与变性

桥式PCR以flowcell表面所固定的序列为模板，进行桥形扩增。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集中成束，每一个束都含有原来单个DNA模板的很多分拷贝，这一过程的目的在于实现将单一碱基的信号强度进行放大，以达到测序所需的信号要求。

4.测序

向反应体系中同时添加DNA聚合酶、接头引物和带有碱基特异荧光标记的4中dNTP。同时在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用激光激发荧光信号，并由光学设备完成荧光信号的记录，最后利用计算机分析将光学信号转化为测序碱基。这样荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应。

来源：简书