单细胞RNA测序揭示了胶质母细胞瘤进展过程中免疫景观的演化

基本信息

题目：Single-cell RNA sequencing reveals evolution of immune landscape during glioblastoma progression 期刊：Nature Immunology 发表时间：2022 单位：Department of Medicine, Beth Israel Deaconess Medical Center, Harvard Medical School, Boston, MA, USA 组织类型：de novo GBM mouse model2–4 wherein tumors are initi ated in situ from conditional (Cre/Lox) overexpression of human EGFR combined with loss of Cdkn2a and Pten. 组学：scRNA, FASC 测序平台：InDrop 样本数：4 细胞数：CD45- (27,633), CD45+ (36304) 数据下载：GSE195848, GSE196174, GSE196175, GSE195813

背景知识

该研究通过运用scRNA测序技术，深入探索了胶质母细胞瘤（GBM）发展过程中的免疫微环境。在这种无法治愈的原发性恶性脑癌中，发现了大量的促肿瘤免疫成分。研究表明，在GBM的发展早期，存在一种促炎症的小胶质细胞亚群。然而，在肿瘤晚期，发现抗炎免疫细胞和促肿瘤的骨髓来源的抑制细胞MDSC的出现。这种演变过程与血脑屏障的破坏以及表皮生长因子受体阳性GBM细胞的广泛增长有着相似的特征。在低级别胶质瘤和GBM的患者活检样本中，也发现了微胶质细胞和巨噬细胞之间的类似关系。此外，本文研究了标准治疗方法特莫唑胺和放疗对小鼠GBM免疫组成的影响。结果显示，特莫唑胺能够降低骨髓来源的抑制细胞的积累，而同时给予特莫唑胺和辐射治疗则会增加肿瘤内的GranzymeB+ CD8+T细胞，但也会增加CD4+调节性T细胞的数量。

总的来说，该研究展示了免疫细胞在GBM发展过程中的演变景观，特莫唑胺对GBM的免疫细胞组成有显著影响，这为GBM的治疗策略提供了重要的线索。

主要内容

图1 scRNA-seq 鉴定了GBM中的CD45–和CD45+细胞群。

(a) 代表性的GBM发展随时间的MRI，附带BLI输出。

(b) MRI-BLI，数据以生物独立重复的均值±标准差呈现。

(c) 正常和GBM小鼠的脑CD45–（n=27,633）和CD45+（n=36,304）细胞的UMAP图，展示主要的细胞类型和亚型。

(d) Ptprc（CD45）在CD45–和CD45+ UMAP上的表达。

(e) 人类EGFR基因（EGFR）和iCre重组酶（e）转录本在CD45–和CD45+ UMAP上的表达。

(f) 来自所示EGFR+ GBM细胞群的细胞表达G1、G2M和S期标记的百分比。

(g) CD45–和CD45+细胞的top基因的热图。

图2 GBM由转录上存在差异的EGFR+癌细胞群组成。

(a) EGFR+细胞群在Cre病毒注射后的7、14和21天的面积。

(b) >30天晚期GBM的五彩斑点切片。比例尺，左侧面板100μm，右侧面板500μm。NB，正常脑。

(c) 小鼠中早期（10天）和晚期（>30天）Cre病毒注射后的荧光细胞（A和B）或细胞群（C和D）。

(d) EGFR+细胞群上的Monocle3轨迹推断。

(e) EGFR+细胞群0和5之间的差异表达基因（DEGs）。

(f) EGFR配体Hbegf和Tgfa在UMAP上的表达。

(g) Lgals1（GAL1）和Pdgfra在UMAP上的表达。

(h) hsEGFR+PDGFRA+和hsEGFR+GAL1+流式分选细胞的批量RNAseq的差异表达基因的热图。

(i) hsEGFR+PDGFRA+和hsEGFR+GAL1+流式分选细胞的批量RNAseq的差异表达基因的火山图。

(j) hsEGFR+PDGFRA+和hsEGFR+GAL1+细胞群中上调基因的Reactome分析。

图3 EGFR GBM中存在增殖性小胶质细胞。

(a) 小胶质细胞群2、4和19中细胞周期基因的表达。

(b) EdU流式图和小胶质细胞的定量。分别对应于7、14和21天的n=7、4和3。

(c) GBM小胶质细胞的增殖指数随时间变化。Ki67阳性微胶质细胞占总微胶质细胞的百分比。数据以生物独立重复的均值±标准差呈现，对照组脑天0 n=3，GBM和对侧n=7、4和3，分别对应于10-15、20-25和>30天。

(d) GBM进展过程中小胶质细胞含量的增加，以活细胞百分比表示。数据以生物独立重复的均值±标准差呈现。对照组脑天0 n=5，GBM n=8、7和5，对侧n=8、5和5，分别对应于10-15、20-25和>30天。统计分析，相对于对照组脑小胶质细胞（天0）。

(e) EdU+和EdU–流式分选微胶质细胞的差异表达基因的热图。

(f) 流式分选小胶质细胞（EdU+、EdU–）、巨噬细胞和对侧微胶质细胞的转录组的Spearman相关性与指示的RNAseq数据集的相关性。

(g) EdU+和EdU–流式分选小胶质细胞群之间的差异表达基因和GO分析。

(h) 流式分选正常脑小胶质细胞和携带GBM的对侧微胶质细胞之间的差异表达基因和GO分析。

(i) 小胶质细胞群2和4之间以及群2和19之间的差异表达基因。

(j) 小胶质细胞群上的Monocle3轨迹推断。

(k) EdU+和EdU–小胶质细胞群的Reactome分析。

图4 GBM中细胞因子、检查点受体及其配体主要在CD45+区域中表达。

(a) 来自GBM流式分选的CD45+和CD45–细胞的细胞周期基因的RT-PCR log2FC。数据以生物独立肿瘤的均值±标准差呈现，n=3。

(b) 来自CD45–和CD45+ scRNA-seq数据集的指示细胞因子及其受体的标度表达。

(c) UMAP图展示Tnf的表达量。

(d) GBM肿瘤的流式细胞术中TNF平均荧光强度（MFI）表达。数据以生物独立肿瘤的均值±标准差呈现，n=3，5和5，分别对应于正常脑小胶质细胞、肿瘤相关小胶质细胞和巨噬细胞。

(e) UMAP图展示Cxl12和Cxcr4的表达量。

(f) 来自CD45–和CD45+ scRNA-seq数据集的指示检查点受体和配体的表达。

(g) Cd274（PD-L1）、Pdcd1lg2（PD-L2）和Pdcd1（PD-1）基因的表达。

图5 免疫细胞浸润的动态变化

(a) 正常脑、早期和晚期GBM的UMAP图，展示重要的细胞类型及细胞亚型。

(b、c) 来自scRNA-seq数据和用于scRNA-seq的GBM样本的EGFR+（b）和细胞类型（c）的相对数量。

(d) 来自scRNA-seq的小胶质细胞和巨噬细胞的组成。

(e) GBM中EGFR+和CD45+细胞的流式细胞筛选。

(f) 指示GBM细胞类型的流式细胞筛选。

(g、h) 寡突细胞群9和12的拟时间轨迹（root聚类12）（g）和差异表达基因（h）。

(i、j) GBM BBB完整性评估。GBM脑部EB和NaF给药后的代表性光镜照片和定量（i）。数据以生物独立重复的均值±标准误呈现。EB，n=3、5、4、5和4，分别对应于天0、10、20、25和30+，NaF，n=2、5、4和3，分别对应于天0、10、20和30+。

图6 随时间推移，巨噬细胞和小胶质细胞逐渐丧失促炎特性

(a) 早期与正常和晚期GBM肿瘤之间小胶质细胞群2和4的差异表达基因的火山图。

(b) 晚期与早期GBM肿瘤中DC群1、中性粒细胞/PMN-MDSCs群11和巨噬细胞群6和20的差异表达基因的火山图。

(c) 细胞因子配体：受体对分析。正常、早期和晚期GBM样本中指示细胞类型群的配体和受体的表达水平绘制。

(d) 来自GSEA的指示小胶质细胞和巨噬细胞群的标准化富集分数（NES），用于分析具有促炎性“M1”极化， 和抗炎、促肿瘤的“M2”极化。

图7 TMZ和放射改变GBM免疫微环境并延长生存。

(a) 对照组非GBM携带小鼠和早期GBM小鼠的BM和脾脏的流式细胞筛选，指示的细胞类型和祖细胞。

(b) 与a中相同的脾脏细胞的流式细胞筛选，指示的细胞标记物和检查点分子。

(c) GBM小鼠用对照药物或每日25或66.7 mg kg−1 TMZ治疗的Kaplan-Meier生存分析。TMZ 66.7 g kg−1相对于对照组*P<0.0001，NS，不显著，log-rank（Mantel-Cox）。数据来自生物独立重复，对照组，25和66.7 mg kg−1 TMZ分别为13、6和7。

(d) 对照组和TMZ治疗（25 mg kg−1或66.7 mg kg−1每日）小鼠的GBM中指示细胞类型的流式细胞筛选。对照组和TMZ治疗的比较。数据以生物独立重复的均值±标准误呈现，对照组，25.0和66.7 mg kg−1 TMZ分别为5、3和5

(e) 用对照药物、25 mg kg−1 TMZ、IR和IR/TMZ治疗的GBM小鼠的Kaplan-Meier生存分析。数据表示生物独立重复，对照组，25 mg kg−1 TMZ，IR和IR/TMZ分别为13、6、4和5，*P<0.0001，log-rank（Mantel-Cox）。

(f) 对照组和TMZ（25 mg kg−1），IR（2 Gy/day）和IR/TMZ治疗的GBM小鼠的指示细胞类型的流式细胞筛选。

图8 低级别胶质瘤和GBM患者的免疫异质性。

(a) 低级别和GBM患者肿瘤样本中细胞类型的流式细胞筛选比例。

(b) 与a中的肿瘤相同的Tregs、CD4+T和CD8+T的流式细胞筛选比例，

(c) 低级别和GBM肿瘤中CD11b+细胞的百分比， 以及IDH1 R132H突变体和IDH1野生型胶质瘤的流式细胞筛选比例

(d) 在低级别和GBM中，单核细胞和巨噬细胞被合并，对于Tregs、CD4+和CD8+淋巴细胞，低级别、GBM、IDH1 R132H突变体和IDH1野生型胶质瘤。

低级别和GBM分别为5和8。

小结

总之，该研究提供了一个全面且无偏见的视角，展示了免疫细胞在GBM发展过程中的演变景观，这对于未来GBM的治疗干预具有重要的参考价值，为未来的治疗策略提供了新的思路。