单细胞和空间分析揭示在结直肠癌中FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的相互作用

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文章基本信息

题目：Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages in colorectal cancer 期刊：NC (IF: 16.6) 发表时间：2022 单位：上海交大 组织类型：非转移的 colorectal cancer 结直肠癌 组学：scRNA + ST 测序平台：10X Genomics 样本数：5 肿瘤（2例结肠腺癌(COAD)，3例直肠腺癌(READ)），5 个对应的癌旁， 4个对应的空转 细胞数：54,103 (29,481个normal，24,622个CRC) DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-022-29366-6 数据下载：https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa-human/request/HRA000979

背景知识

1. CRC（结直肠癌）是一种常见的恶性肿瘤，除了手术外，治疗选择有限。
2. PD-1靶向抗体pembrolizumab只对高度微卫星不稳定（MSI-H）的错配修复缺陷性肿瘤有效，这种类型的肿瘤占转移性CRC病例的<5%。
3. 最近的研究发现，间质细胞和髓系细胞可能形成肿瘤生长和转移的肿瘤微环境，从而成为潜在的治疗靶点。
4. 间充质干细胞（mesenchymal stem cells）是一种具有多能性和自我更新能力的细胞类型，可以分化为多种细胞类型。在该文件中，研究人员将间充质干细胞的一个亚群体标记为FAP+成纤维细胞。
5. 肿瘤免疫微环境通常可以根据免疫细胞和CD8 +T细胞的浸润被归类为免疫排除型immune-excluded、发炎型inflamed (hot)和免疫荒漠型immune-desert等类型。
   • 免疫排除型肿瘤指的是免疫细胞虽然浸润到肿瘤组织中，但无法进入肿瘤核心区域进行有效的抗肿瘤应答。
   • 热肿瘤是指具有充分的免疫细胞浸润，对免疫治疗有良好反应的肿瘤类型。
   • 免疫荒漠型肿瘤则是指在肿瘤组织中几乎没有免疫细胞浸润的情况。
6. 整体生存（Overall Survival，OS）是指在特定时期内（通常是从诊断到死亡）所有患者的存活情况的评估。 无进展生存（Progression-Free Survival，PFS）是指在治疗期间或治疗结束后，患者在没有疾病进展或复发的状态下存活的时间。整体生存和无进展生存是两个在癌症研究和临床实践中常用的评估指标，用于评估患者的生存状况和治疗效果。

细胞类型鉴定

b/c/d: 用Harmony去除批次效应，并用经典marker进行细胞类型注释；

e: 细胞类型在样本及组织中的百分比；

附图

对6个细胞类型，进行降维聚类，并进行细胞亚型注释，共得到58个细胞类型/亚型。作者利用这个注释结果，得到每个细胞类型/亚型的top基因，用于CIBERSORTx模型的预测基因集。

浸润的MSC与Myeloid细胞成正比

主图

a: hallmark 50个代谢通路，在CRC和癌旁的差异

The gene signature score for each cell was calculated by the mean scaled expression across all genes in the signatures.

immune-related pathways, including inflammatory response, IL2/STAT5 signaling, and IL6/JAK/STAT3 signaling, were enriched in CRC

b/c: 利用scRNA数据，构建9个细胞类型的训练基因集，利用CIBERSORTx网站预测TCGA和GEO的bluk RNA数据集，得bulk RNA样本中细胞类型的占比，并做相关性分析。

从b/c可以看出，MSC和Myeolid的比例，在所有数据集中，都是正相关的。

Spearman correlation coefficient [|Rs|] > 0.3 and false discovery rate [FDR] <0.05 were considered significant correlation

d/e: MSC和Myeloid的浸润，与OS, PFS的预后关系。

MSCs (left) or myeloid cells (right) are associated with worse OS (d) and PFS (e)

FAP+ fibroblasts相关分析

主图

a: 将MSC细胞类型，降维聚类，分成10个细胞亚型；

b: 10个细胞亚型在每个样本中的细胞占比；

c: FAP+ fibroblasts在Tumor中的比例显著升高；

d: TCGA-COAD数据集中，FAP+ fibroblasts在tumor中的比例也显著高；

e: 高浸润FAP+ fibroblasts的病人，预后差；

f: 用于鉴定10个细胞亚型的marker的小提琴图；

g: 用流式分选FAP+ fibroblasts，验证在tumor中显著高；

h: RNA velocity分析表明，FAP+ fibroblasts有可能起源于FGFR2+ fibroblasts 或 ICAM1+ telocytes;

i/j/k/l: 用pySCENIC分析，10个细胞亚型的top 转录因子和调节子，发现TWIST1 是FAP+ fibroblasts特异性表达；

m: TWIST1与缺氧相关，参与HIF1a signal pathway，将每个细胞的pathway 得分映射到UMAP图中。

tips：利用CIBERSORTx预测细胞亚型在bulk RNA中的占比，需要用很特异的marker

The analysis was performed using CIBERSORTx with cell-type-specific gene expression profiles for 58 cell types defined by our scRNA-seq

附图

a：5例病人的UMAP图；

b: 10个细胞亚型，在tumore/normal分组中的占比；

c: GSE17536数据集中，高浸润FAP+ fibroblasts的病人，预后差；

d: FAP+ fibroblasts在不同CRC分子分型中的占比不同，FAP+ fibroblasts在恶性程度高的分型中，比例相对较高；

e/f: 流式分选，验证细胞亚型占比；

g: FAP+ fibroblasts 与 FGFR2+ fibroblasts 相比，差异基因火山图

h: FAP+ fibroblasts 与 ICAM1+ telocytes 相比，差异基因火山图

i/j/k: KEGG pathway analysis of the differential expressed genes between FGFR2+ fibroblasts and FAP+ fibroblasts (i) or ICAM1+ telocytes and FAP+ fibroblasts

针对FAP+ fibroblasts的分析：

1. FAP+ fibroblasts在分组中的占比有显著差异；
2. 用TCGA、bulk RNA数据集、流式分选 验证FAP+ fibroblasts在tumor中的比例高；
3. FAP+ fibroblasts比例高的样本，预后差，说明FAP+ fibroblasts促进肿瘤的发生发展；
4. 用SCENIC分析FAP+ fibroblasts特异的TFs，regulons,及信号通路；
5. 用RNA velocity 推断FAP+ fibroblasts的起源，并做差异富集分析。

得到结论：FAP+ fibroblasts在肿瘤中占比高，预后差，促进肿瘤的发生发展。

SPP1+ macrophage相关分析

主图

a: 将Myeloid细胞类型，降维聚类，分成9个细胞亚型；

b: 9个细胞亚型在每个样本中的细胞占比；

c: SPP1+ macrophage在Tumor中的比例显著升高；

d: TCGA-COAD数据集中，SPP1+ macrophage在tumor中的比例也显著高；

e: 高浸润SPP1+ macrophage的病人，预后差；

f: 用于鉴定9个细胞亚型的marker的小提琴图；

g: 用流式分选SPP1+ macrophage，验证在tumor中显著高；

h: RNA velocity分析表明，SPP1+ macrophage有可能起源于THBS1+ macrophage;

i/j/k/l: 用pySCENIC分析，10个细胞亚型的top 转录因子和调节子，发现STAT1 是SPP1+ macrophage特异性表达；

FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophage相关性分析

主图

a: 通过scRNA数据，在9个细胞类型中，共鉴定到58个细胞亚型。通过CIBERSORTx网站预测大量14个CRC bulk RNA数据集中细胞亚型的比例，发现 FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophage相关性最强；

b: FAP+fibroblastsHigh SPP1+ macrophagesHigh 的生存率是最低的；

c: FAP+fibroblastsHigh SPP1+ macrophagesHigh 和 FAP+ fibroblastsLow SPP1+ macrophagesLow 相比，GSEA富集到的4个通路，均与肿瘤的发生发展相关；

d/e: FAP 和 SPP1的蛋白水平，在tumor中也是显著高表达的。

the protein expression levels by the H-score system in tissue microarray (TMA)of 78 CRC patients to identify FAP and SPP1 both specifically increased in tumor tissue compared with adjacent normal tissue (Fig. 5d, e)

H-score系统是一种评估免疫荧光染色结果的方法，用于确定某一标记物在组织样本中的表达水平

f/g/h: FAP 和 SPP1的蛋白表达量高，预后差。

i/j: 用免疫荧光验证FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophage在肿瘤组织中高表达，且距离很近。

FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophages空间分布

主图

a/b/c: 6号病人的切片结果，并注释成10个细胞类型；

d/e/f: 7号病人的切片结果，并注释成6个细胞类型；

Signature scoring derived from scRNA-seq or ST signatures was performed with the AddModuleScore function in Seurat.

g/h/i: FAP+ fibroblasts, SPP1+ macrophages 和 malignant epithelial cells 的top25 基因的score值，在空间上的映射，发现FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophages 分布在 malignant epithelial cells 周围；

j/k: 在6号和7号病人中，FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophages的得分，成正相关；

i: FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophages阳性的spot，GO富集到细胞外基质重塑通路；

j: 免疫细胞在肿瘤内部分布非常少，即 FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophages 组织了免疫细胞的浸润。

FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophages相互作用

主图

a: 用NicheNet做细胞通讯分析，发现FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophages通过 COL1A1/LAMA1-

ITGB1, WNT5A-FZD2, CCL3-CCR5,RARRES2-CMKLR1等配受体对，发挥作用。

b/c: RARRES2主要在FAP+ fibroblasts中高表达，而CMKLR1在THBS1+ macrophages 和 SPP1+ macro

phages中高表达；

FAP+ fibroblasts might function as a driver, promoting SPP1+ macrophage differentiation through chemerin.

d: RARRES2编码chemerin， 而chemerin在肿瘤中高表达，存进肿瘤发生发展。

Concentration of chemerin was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit

e图之前，作者介绍了SPP1+ macrophages促进FAP+成纤维细胞的ECM重塑能力，重点突出SPP1+ macrophages作为配体， FAP+ fibroblasts作为受体的的配受体对

Therefore, we investigated whether SPP1+macrophages promote the ECM remodeling ability of FAP+fibroblasts.

e: SPP1+ macrophages作为配体的top-ranked ligands inferred to regulate FAP+ fibroblasts by SPP1+ macrophages.

f: 这些配体在细胞亚型中的表达量

g: 配体对用的受体，在FAP+ fibroblasts中的表达量

h: 20个配体在FAP+fibroblasts受体，对应下游靶基因的表达量。这些基因都是与细胞外基质重塑相关的，符合Fibroblasts的生物学意义。

i: 这些靶基因的KEGG富集通路，最重要的是 cytokine-cytokine receptor interaction 和 extracellular matrix pathways

j: 聚焦前三个配体（由TGFB1、IL1A和IL1B编码）和ECM相关靶点之间的信号通路，发现了40个下游调节因子，包括HIF1A、AKT1、STAT1和NFKB1，它们参与将SPP1+巨噬细胞分泌的配体与ECM靶基因连接起来的信号通路，从而有助于形成脱髓鞘区域

FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophages对免疫治疗的影响

主图

a/b/b/d: 用TCGA-COAD数据集，将所有的样本，根据FAP和SPP1的表达量，分成四组，查看这四组中的突变信息；

e: 这四组中，淋系细胞的浸润比例；

f/g/h: 用IMvigor210数据集，该数据集是PD-1治疗的数据集，查看FAP高(f), SPP1高 (g)和FAP+SPP1都高 (h)的预后。发现FAP, SPP1对PD-1免疫治疗效果不好。

i: FAP+SPP1高表达量的病人，完全缓解[CR]和部分缓解[PR]较低，但普遍进展性疾病（PD）较多，而低表达FAP和SPP1的患者较少（图8i），表明富含FAP或SPP1的患者对抗PD-L1治疗的反应明显较差。

patients expressing high levels of either FAP or SPP1 showed a lower response (complete response [CR] and partial response [PR]), but more progressive disease (PD) than patients with ow expression of both FAP and SPP1 (Fig. 8i), suggesting that FAP or SPP1-enriched patients have a significantly poorer response to anti-PD-L1 treatment than other patients.

j: FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophages互做的模型。

主要结论：

1. scRNA数据表明，FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophages在肿瘤中的比例是显著高的；
2. TCGA和14个公共数据集，都表明FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophages在独立队列中呈正相关；
3. 免疫荧光染色和空间转录组学证实FAP+ fibroblasts 和 SPP1+ macrophages的紧密定位。
4. 这种相互作用可能由chemerin、TGF-β和白细胞介素-1调控，这些因子会促使免疫排除的结缔组织形成并限制T细胞浸润。
5. 发现FAP或SPP1表达高的患者在抗PD-L1治疗队列中的治疗效果较差。