单细胞多组学刻画EGCs特征

生信技能树jimmy

发布于 2023-08-31 11:21:38

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发布于 2023-08-31 11:21:38

文章被收录于专栏：单细胞天地

小结

“Single-cell multiome sequencing clarifies enteric glial diversity and identifies an intraganglionic population poised for neurogenesis”。2023年发表在cell reports上的一篇文章。单细胞multiome 的描述性文章。本研究主要应用 scRNA-seq 和多组测序技术同时测量单个细胞核中的 ATAC 信号和 RNA 转录本（scMulti-seq）来描述 EGCs 的特征并研究神经元分化的动态变化。

文章主图

Fig1.肠道胶质细胞(EGCs)是神经元祖细胞
Fig2. 多组测序揭示了神经球中 EGC 神经发生的染色质准备状态
Fig3. 小肠肌胶质细胞具有转录多样性，且包含准备用于神经发生的细胞
Fig4. IF 和 RNAscope 证实，在出生后早期和断奶后，神经节内 EGC 都富含准备进行神经发生的细胞

文章结果

1 构建EGCs分化神经元的模型

分别从Plp1::GFP 和Actl6b::Cre;(R)26-tdTomato 小鼠体内分离细胞。GFP标记 EGCs细胞，tdTomato标记能分化成神经元的细胞。Fig1A中Day1没有day5有红色tdTomato 细胞，说明分得的是纯EGCs细胞并成功分化出神经元。分离无神经元的tdTomato，经过培养后，分化成神经元，进一步证实神经球里有神经发生。模型构建成功。然后先做了单细胞测序，分别测了神经球中的GFP+和GFP-细胞。分群结果见Fig1D-F。GFP-细胞大部分是间质细胞。

Fig1. 肠道胶质细胞(EGCs)是神经元祖细胞

2 神经球内 EGC 向神经元转变的多组学分析揭示了一种为神经发生做好准备的染色质结构

然后神经球里的GFP+细胞测了单细胞Multiome(细胞来源三只小鼠)。分群结果Fig2A-B，与scRNAseq结果类似。然后通过R包ChromVAR识别转录因子结合基序富集。与从神经胶质细胞到神经元的命运转变相一致，结果发现从 SOX10 和 SOX2 富集到 ASCL1 和 PHOX2B 底物富集的转变（Fig 2C ）。从 EGCs 向神经元转变的过程中染色质出现了净关闭（Fig 2D-E），许多与EGC相关的ATAC峰在分化方向更远的细胞群中信号减弱。相反，在与神经元细胞相关的峰上，染色质的可访问性越来越高（Fig2F）。当细胞向神经元命运发展时，Sox10 基因周围的几个峰显示出明显的信号减弱（Fig2H）。许多与神经细胞或神经元相关的 ATAC 峰在 EGCs 中对核酸酶敏感（FIg 2F、2G 、 2I），这表明它们是可被激活以触发神经发生的调控元件。神经元分化有关的Camta1基因非编码区内的一个ATAC峰27 ，发现虽然神经母细胞中的chromatin可及性最高，但胶质细胞也对该区域的核酸酶敏感（Fig 2I）。

Fig2. 多组测序揭示了神经球中 EGC 神经发生的染色质准备状态

3 出生后小肠中的EGC具有转录多样性，包括具有神经发生所需的染色质结构的细胞

接着又用小鼠出生大约14天后的GFP+ 细胞测了单细胞Multiome。Fig3A-C是数据的分群聚类。其中cluster4高表达神经分化相关的基因如Phox2b, Hand2, Tbx3, Ascl1, Hoxa5和Hoxb5。chromVAR分析cluster4 富集的motif，发现了PHOX2B, PHOX2A和HAND2 (Fig3D) 。ATAC 信号在cluster4 neuroblast peaks 富集(Fig3E). Cluster4和所有其他细胞中 ATAC 计数大于 0 的 457 个 neuroblast peaks的火山图显示，单个 neuroblast peak明显向cluster4富集的方向倾斜(Fig 3F) 。大多数EGC在这些及引导 TSS上游染色质开放(Fig3G,cluster8 除外)。神经marker Elavl4的TSS附近都具有核酸酶敏感性(Fig3H)

Fig3. 小肠肌胶质细胞具有转录多样性，且包含准备用于神经发生的细胞

4 在小鼠断奶前后，具有神经源潜能的 EGCs 被限制在肠肌神经节中

接着验证了marker的表达情况。有报道Gfap 标记EGCs的一个亚群。本文测序分析得到的Sox2 和Gfap都是在intraganlionic 中表达更高(Fig.4A-D). EdU染色表明EGCs在断奶后并没有失去增殖能力(Fig4E-F ). 接着用RNAscope 测Plp1::GFP+ 中基因的表达(FigG-I ).Gfap 转录本在intraganlionic的EGC 中更丰富。