单细胞测序构建糖尿病足溃疡图谱

前言

题目：Single cell transcriptomic landscape of diabetic foot ulcers 日期：2022-01-10 期刊：Nature Communications 链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-27801-8

摘要

糖尿病足溃疡 (DFU) 是糖尿病的一种严重并发症，其发病机制还不清楚。本文使用单细胞转录组对患者足部、前臂和外周血单核细胞的 174,962 个单细胞进行分析，发现在一个特殊的成纤维细胞群中存在一些基因的过表达：MMP1、MMP3、MMP11、HIF1A、CHI3L1和TNFAIP6。并且伤口愈合的 DFU 患者的 M1 巨噬细胞增加。空间转录组学分析表明，与未损伤或伤口边缘的皮肤相比，这些愈合相关的成纤维细胞更倾向于分布在伤口床（wound bed）。M1巨噬细胞和M2巨噬细胞分别在治疗者和非治疗者中有较高的细胞丰度。本文确定了可能对DFU愈合有效的重要细胞类型，为其治疗提供新方法。

DFU的愈合与成纤维细胞的关系

作者选取了17名糖尿病患者（11例有DUF，6例无DUF），10例非糖尿病的健康人。采集了足部、前臂的皮肤组织和血液进行单细胞测序，总共174962个细胞（94325个细胞来自于足部，37128个来自于前臂，43455来自于血液），降维聚类分群得到37个细胞群，注释得到21种细胞类型：平滑肌细胞、SMC（TAGLN+、ACTA2+）；成纤维细胞，Fibro ( DCN+ , CFD+); 血管内皮细胞，VasEndo ( ACKR1+ )；T-淋巴细胞，T-淋巴细胞（CD3D+）；CD14+ 单核细胞，CD14-Mono (CD14+ , S100A9+ )；分化的角质形成细胞，DiffKera ( KRT1+ , KRT10+ )；基底角质形成细胞，BasalKera ( KRT5+ , KRT14+ )；自然杀伤细胞，NK ( CCL5+ , GZMB+ )；NK 和 T 细胞，NKT（CD3D+，CCL5+）；CD16+ 单核细胞，CD16-Mono ( FCGR3A+ /CD16+ ); M1 巨噬细胞，M1-Macro ( IL1B+ )；M2 巨噬细胞，M2-Macro ( CD163+ )；Melano/Schwann ( MLANA+ , CDH19+ )；汗液和皮脂腺细胞，Sweat/Seba ( DCD+ ); 淋巴管内皮细胞，LymphEndo ( CCL21+ )，红细胞，Erythro ( HBB+ )；树突状/朗格汉斯细胞，DC（ GZMB+， IRF8+）；B-淋巴细胞，B-淋巴细胞（CD79A+ , MS4A1+）；浆细胞，血浆（ MZB1+) 和肥大细胞 Mast ( TPSAB1+ )

通过比较不同组直接的细胞类型数量差异，成纤维细胞存在显著的异质性，并且发现一个独特的成纤维细胞类型——愈合样本富集的成纤维细胞 (HE-Fibro)，因为在DFU-Healers的样本中数量明显多。

不同部位的细胞异质性

作者通过比较足部、前臂和血液的细胞组成，发现不同组织部位细胞存在较大的异质性。足部样本中主要富含纤维母细胞、平滑肌细胞、黑色素细胞、汗腺细胞、血管内皮细胞和淋巴内皮细胞；足和前臂样本中主要包含基底角质形成细胞和分化角质形成细胞；免疫细胞主要在PBMC样本中占多数。

不同临床样本的PBMC转录图谱比较分析

为了更好的理解DUF在系统层面的影响，本文单独分析了四个临床组的PBMC样本，分别是健康组(没有糖尿病的健康受试者)、DFU-healer(有治愈性DFUs的糖尿病患者)、DFU-non-healer(未治愈的糖尿病患者)和糖尿病组(没有DFU的糖尿病患者)。

发现DFU-healer中有更多的naive 和早期的T淋巴细胞，并且表达CCR7，说明它们对激活其他的T细胞亚群具有重要的作用。另外，DFU-healer中高表达T细胞特异性基因，如IL7R、TCF7和CCR7，而DFU-non-healer高表达NKT系列基因，如NKG7、GNLY、CCL5和KLRD1。富集分析表明，与DFU-Non-healers相比，DFU-Healers在系统水平上抑制了关键的免疫和炎症通路，包括IL-6、IL-8、T辅助细胞中的CD28信号通路、ico-icosl通路以及RhoGDI和EIF2信号通路的激活。

不同临床足部样本的转录图谱比较分析

作者对26个足细胞样本中的94,325个细胞进行分析，并分组进行展示。与DFU-non-healer、糖尿病患者和健康对照相比，DFU-Healers组HE-Fibro细胞数量明显增加。与DFU-non-healer组相比，DFU-Healer 组还显示出 M1 巨噬细胞（促进炎症的经典活化巨噬细胞）的比例明显高于 M2 巨噬细胞（具有抗炎特性的活化巨噬细胞）。

从 DFU-Healers vs. Non-healers 和 M1 巨噬细胞 vs. M2 巨噬细胞的差异分析结果中拿到了195 个基因，在DFU-Healers 的 M1 巨噬细胞中高表达，发现其中已知的炎症反应调节因子IL17信号通路被激活，同时一些上游调控因子被激活，包括HIF1A, TNF等。

愈合相关的成纤维细胞反应机制

作者为了进一步了解成纤维细胞在伤口愈合中的作用，分析了成纤维细胞的14个亚群，它们代表了成纤维细胞的不同分子状态或亚型。每个cluster的表达谱都有很大的异质性，其中cluster3中含有很多表达ECM重构相关基因（包括MMP1和MMP3）的细胞，cluster 4的细胞则高表达POSTN和ASPN，与ECM信号、粘附和迁移有关。

针对每个cluster又拿到了与愈合相关的marker基因，包括ECM重塑和炎症反应相关基因:MMP1、MMP3、IL6、CHI3L1、ASPN、POSTN和PLA2G2A。推测CHIL3L1 是驱动 HE-Fibro 愈合的关键参与者之一，它通过同时表达促炎基因和 ECM 基因来改善伤口修复。另外，约38%的细胞同时检测到IL6/TIMP1/ PLA2G2A和CHI3L1转录本，这表明HE-Fibro有共同的调节机制。