凝血相关基因免疫相关分析发13分+SCI

大家好！今天给大家介绍一篇2022年6月发表在Briefings in Bioinformatics(IF:13.994)上的一篇文章。本研究作者对肝细胞癌患者的凝血相关基因进行全面分析并构建预后模型，随后研究两个亚型的免疫水平差异。

Immune infiltration and clinical significance analyses of the coagulation-related genes in hepatocellular carcinoma

肝细胞癌凝血相关基因的免疫浸润和临床特征分析

摘要

肝细胞癌（HCC）早期诊断率低，死亡率率高是最常见的癌症类型之一。凝血级联反应在肿瘤免疫微环境（TME）中起到重要作用。本研究作者收集KEGG数据库中的凝血通路并在HCC患者中鉴定到两种凝血相关亚型，这两种亚型在免疫特征和预后方面具有显著差异。基于TCGA数据集构建凝血相关风险打分模型，用于风险分层和预后预测。此外，作者构建列线图可用于临床应用并使用不同方法验证其有效性。以上结果表明，HCC中凝血与TME具有显著相关性，构建的风险打分模型可以作为预后标志物，为化疗和免疫治疗提供有价值的信息。

流程图

结果

1. 数据集的获取和下载

从KEGG数据库中收集凝血通路，包括hsa04610和hsa04611，将这两条通路中的基因定义为CRGs。从TCGA,GEO和ICGC数据库收集HCC的转录组数据集。

2. CRGs的体细胞突变情况

有65.9%的CRGs发生DNA突变，突变频率为2%-5%（图1A和1B）。ITPR3，PIK3CA，ADCY2，C3和ITPR1的突变频率最高，常见的突变类型为错义突变，移码突变和非同义突变（图1A）。大概有66.57%的患者至少有一个CRGs发生突变（图1F）。ADCY8,FCER1G,FCGR2A,CFH,CFRH3,CFRH1,CFRH2,CFRH4和CFRH5的扩增频率较高（图1G）。此外，发生TP53,PKHD1L1和CTNNB1突变的患者较多（图1C）。KM分析表明，CNA频率较低的患者OS和PFS较高（图1D和1F）。

图1 HCC中CRGs的突变情况

3. 鉴定HCC中凝血相关亚型

基于CRGs的表达水平作者进行非监督聚类分析鉴定到TCGA-HCC患者的两个亚型，簇1和簇2（图2A）。PCA分析可以将簇1和簇2分开（图2B）。KM分析表明，簇1的生存情况优于簇2（图2C）。两个亚型的临床特征如图2D所示，簇1患者较多为G1期，TNM 1和1期，两个亚型的临床特征具有显著差异，CRGs在两个亚型的表达水平如图2E所示。

图2 基于CRGs的一致性聚类

4. 两个亚型的免疫水平

首先，作者对两个亚型进行GSVA分析，簇1富集T细胞受体信号通路，B细胞受体信号通路和趋化因子信号通路等（图3A）。此外，簇1种高表达的DEGs在T细胞受体信号通路，B细胞受体信号通路，Th1，Th2和Th17细胞分化中显著富集（图3B）。随后，作者使用ImmuneCellAI工具研究两个亚型的TME（图3C）。簇1中B细胞，CD8 naïve，CD4 naïve，CD4 T，CD8 T和NKT细胞等浸润水平较高而簇2种DC，iTreg，单核细胞和中性粒细胞等浸润水平较高。使用ESTIMATE计算患者的基质打分，免疫打分和ESTIMATE打分，簇1的基质打分，免疫打分和ESTIMATE打分较高（图3D）。组织相容性复合体和T细胞刺激因子分析表明，除了HLA-B和HLA-C外簇1中组织相容性复合物和T细胞刺激因子的表达水平较高（图3E和3F）。TMB，TIDE打分和免疫检查点分子表达水平分析表明簇1中PD-1,PD-L1,CTLA4,HAVCR2,LAG3和TIGIT的表达水平较高，TMB和TIDE打分较高（图4A-4C）。HCC患者常用药物的分析表明，簇1的索拉非尼，阿霉素和长春见的IC50值较高（图4D）。

图3 两个亚型的临床特征和免疫水平

图4 两个亚型对免疫治疗和化疗的反应

5. 鉴定关键CRGs

使用STRING数据库构建CRGs的PPI网络，包括200个节点和6742条边（图5A）。使用两种拓扑算法鉴定网络中的核心基因，排名前20位的基因如图5B所示。此外，作者使用GSE19151数据集进一步筛选关键CRGs，差异分析鉴定到740个DEGs（图5C），将这些DEGs与这20个基因取交集鉴定到3个关键CRGs（PRKACA,PIK3R1和ITGB2）（图5D）。这3个基因的表达水平分析表明PRKACA和ITGB2在肿瘤样本中上调表达，PIK3R1主要在LIHC,THCA和KIRP中上调表达（图5E）。KM分析表明，这3个基因在多种癌症中发挥保护作用（图5F）。

图5 鉴定PPI网络中的关键CRGs

基于4个额外HCC数据集的表达水平分析表明，PIK3R1在肿瘤样本中上调表达，其余两个基因的表达水平没有显著差异（图6A和6B）。因此，作者重点研究PIK3R1，PIK3R1的CNA频率高于其他两个基因（图6C）。甲基化分析表明，肿瘤样本中ITGB2和PIK3R1的beta值高于正常样本（图6D）。单因素Cox回归分析表明，PIK3R1作为肝癌的保护因子（图6E）。KM分析表明，PIK3R1与HCC患者的OS显著相关（图6F）。多因素Cox回归分析表明PIK3R1是独立预后因子（图6G）。

图6 验证关键CRGs的表达水平和预后特征

6. 构建凝血相关预后模型

首先，作者LASSO Cox回归分析构建CRGs相关预后模型（CRRS），包括11个CRGs（图7A和7B）。图7C为11个CRGs表达水平与OS相关性的森林图。CRRS的风险打分计算方法如图7D所示。高CRRS组患者的死亡比例较高，而簇2中高CRRS的患者比例较高（图7F）。CRRS和其中各个基因的C index如图7E所示。ROC曲线表明，CRRS模型的AUC最大（图7G）。

图7 基于训练集构建CRRS模型

基于CRRS打分的中位数将TCGA,ICGA和GEO数据集分为高危组和低危组，这些数据集的风险打分和生存状态如图10A所示。KM分析表明，高危组的OS较差（图10C），TCGA数据集1年，3年和5年的AUC分别为0.799,0.799和0,801（图10B），ICGC数据集1年，2年和3年的AUC分别为0.65,0.67和0.704（图10B），GSE14520数据集1年，3年和5年的AUC分别为0.634,0.557和0.57，GSE10143数据集1年，3年和5年的AUC分别为0.521,0.641和0.743。

图10 CRRS模型的生存期评估

7. 基于风险打分的HCC治疗策略

免疫检查点表达水平分析表明，PD-L1,CTLA4和LAG3的表达水平在高危组中上调（图8A），高危组中的IPS打分较高（图8B）。此外，作者比较高危组和低危组中TMB，TME打分和TIDE打分的分布，高危组中TMB和TME打分较高而TIDE打分较低（图8C-8E）。

图8 CRRS模型的免疫治疗受益情况

免疫治疗反应分析发现，不同凝血亚型间的免疫反应具有显著差异（图9H和9I）。高CRRS患者的SD/PD发生率较高而低CRRS患者的CR/PR发生率较高。将接受免疫治疗反应的患者分为高CRRS组和低CRRS组，其中低CRRS组的OS较长（图9F和9G）。随后，作者使用GSE104580数据集研究CRRS对接受TACE治疗的HCC患者的预测性能（图9A）。此外，使用两个GEO数据集阐述风险打分与PVTT之间的相关性（图9B和9C）。高危组和低危组患者的6种化疗药物的IC50值如图9D所示。使用DGidb数据库鉴定治疗HCC的小分子药物，药物的3D结构断层扫描如图9E所示。

图9 CRRS可以预测门静脉肿瘤血栓的形成和治疗效果

8. CRRS可以作为HCC的独立预后因子

由于CRRS与HCC的恶性程度和肿瘤进展显著相关，作者使用单因素和多因素Cox回归分析研究CRRS是否是HCC患者的独立预后因子。结果表明，CRRS是预测HCC患者预后的独立预后因子（图11A和11B）。随后作者构建列线图（图11C），打分越高患者预后越差。基于TCGA数据集不同变量随时间变化的C index曲线表明，列线图的性能优于其他因素（图11D）。校准曲线表明列线图的准确率较高（图11E）。ROC曲线表明，列线图具有较高的性能（图11F）。

图11 构建列线图

结论

总的来说，作者对肝细胞癌患者的凝血相关基因进行分析并构建CRRS模型，CRRS模型是HCC的可靠预后标志物并与免疫浸润特征和免疫治疗有关。CRRS模型可以作为预测HCC患者生存和治疗的有效工具。本研究的局限性在于，作者分析的数据来源于不同的测序平台可能存在一定异质性，此外还需要一定的实验验证本研究结果的有效性。