临床蛋白质组九步走

生信技能树

发布于 2022-07-26 02:47:18

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我们《生信技能树》早期也分享过蛋白质组学数据处理教程，目录如下：

恰好最近学徒投“菜鸟萌”稿了一个《临床蛋白质组》流程介绍，分享给大家：

文章主图

基于文章主图，我们将临床蛋白质组的处理步骤分为的实验处理，质谱分析和生信分析共9步，分别进行简单介绍：

临床标本蛋白质组学分析最广泛使用的临床标本是血清或血浆的液体活检。各自的蛋白质组具有极高的动态范围，估计超过10个数量级，造成巨大的分析挑战。

固体组织：福尔马林固定石蜡包埋块体(FFPE)、新鲜(冷冻，FF)组织、碱化的头发和指甲、脱矿的骨头、从粪便。

细胞：福尔马林固定石蜡包埋块体(FFPE)及激光捕获解剖(LCM)组织细胞、肿瘤细胞、WBCs(白细胞)、免疫细胞、和红细胞(RBCs)。

体液：尿液、血清/血浆、脑脊液(CSF)、泪液、唾液和腹水。

对于固体组织和细胞来说：需要进行研磨，使蛋白提取液能够充分接触组织。为了提高从微量样品中提取蛋白质的重复性，新兴的半自动化方法如压力循环技术(PCT)被越来越多地采用。

对于部分细胞来说：可以进行超声波降解。

对于福尔马林固定石蜡包埋块体来说：需要通过加热和SDS处理之后脱蜡再进行提取。

**丙酮沉淀 Acetone precipitation **: 蛋白质在酸性或者疏水条件下会发生变性，使蛋白浓缩，可以去除污染物。

蛋白纯化 Depletion: 去除白蛋白ALB和免疫球蛋白。

整膜蛋白(IMPs)富集：在碱性条件下通过超离心富集整膜蛋白(IMPs)。

免疫沉淀 IP: 针对特定靶蛋白的抗体与样品（细胞裂解物等）中的靶蛋白形成免疫复合物，随后利用Protein A-磁珠或Protein G-磁珠将该免疫复合物从混合物中沉淀下来。

SEC: 排除色谱(SEC)分离复合物。

蛋白变性 Denaturation：防止目标蛋白被蛋白酶酶解。

还原 Reduction：酶解前处理一般需要还原蛋白中的二硫键，破坏蛋白结构来加强酶解的效率。常用的还原剂一有二硫苏糖醇（DTT）或三(2-羧乙基)膦（TCEP）。

烷基化 Alkylation: 为了阻止还原后的自由巯基再次形成二硫键，我们经常使用烷基化试剂将巯基封闭，常用的烷基化试剂有碘乙酰胺（IAM，iodoacetamide）、氯乙酰氨（ClAM，chloroacetamide）、碘乙酸和N-乙基马来酰亚胺等。

酶解 Digestion：用蛋白水解酶(最常见的是胰蛋白酶)消化成多肽。消化可以在凝胶中、溶液中、膜上、纳米珠上或通过PCT辅助的方式进行。

翻译后修饰富集 PTM enrichment：通过翻译后修饰富集多肽片段。

串联质谱标签 TMT-based isobaric labeling 标记：TMT (Tandem mass tag)是由ThermoFisher Scientific公司研发的一种多肽体外等重同位素标记的相对与绝对定量技术，采用6、10及16种同位素的标签，通过特异性标记多肽的氨基基团，经高分辨质谱仪串联分析，可同时比较多达16种样品之间的蛋白质表达量，是定量蛋白质组学中的高通量筛选技术。

bRP 分级：basic reversed-phase(bRP)碱性反相分级。

SCX分级：强阳离子交换 (SCX) 分级。

分级的目的：降低每个组分中肽段样品的复杂程度，分别对分级后的每组样本进行LC-MS，能够达到更好的质谱鉴定效果。

Direct fusion : 直接注射适用于纯样品或仅由少量成分组成的简单混合物。至关重要的是，样品还必须没有可能干扰质谱测量的污染因素，如高水平的非挥发性盐/缓冲液和洗涤剂。

Nano-flow LC：与串联质谱联用的纳米级液相色谱（nano LC-MS/MS）已成为蛋白质组学领域的重要工具。事实上，它的灵敏度优于传统的 LC-MS/MS，允许在样品有限的情况下分析肽混合物（例如，通过二维凝胶电泳分离的蛋白水解消化的蛋白质）。

Evosep One: Evosep One 是一种标准化平台，专为稳健性和高通量而设计。这是通过将 Evotips 用作一次性捕集柱来实现的，在该柱中样品离线加载和脱盐。自动进样器拾取吸头并将洗脱与液相色谱相结合。这消除了样品处理步骤并减少了进样周期。

Micro-flow LC:微流 LC-MS 提供灵敏度和稳定性之间的最佳折衷——比传统的分析流 LC 更灵敏，比纳流 LC 更灵活、更稳健。

High-flow LC：高流量柱切换法(双柱系统)提供了比传统高流量法更清晰的峰形。这种影响增加了分析物的信噪比和灵敏度。

肽在质谱分析仪中的分析有三种主要模式。

第一种是**数据依赖采集(data-dependent acquisition, DDA)**，在临床应用中仍被广泛使用，并经常与等压肽标记结合使用。

第二种模式包含有针对性的方法，包括选择/多重反应(SRM/MRM)和平行反应(PRM)监测，可以精确测量样本队列中预测肽段的panel。

第三种模式是数据独立采集(DIA) (Gillet et al.， 2012)，支持对成百上千的临床标本进行比较蛋白质组学分析。基于移动性的离子分离技术的加入降低了蛋白质组在气相中的复杂性，进一步提高了DIA分析的敏感性和特异性(Meier et al.， 2020)，使单次注射、高通量和全面的蛋白质组分析更接近现实。

蛋白质组常见的搜库软件：

MaxQuant：MaxQuant 是一个定量蛋白质组学软件包，专为分析大型质谱数据集而设计。它专门针对高分辨率 MS 数据。支持多种标记技术以及无标记量化。MaxQuant 是免费的，可以从这个站点下载。下载内容包括搜索引擎 andromeda，它集成到 MaxQuant 以及用于检查原始数据和识别和量化结果的查看器应用程序。

MSFragger：MSFragger 是一种超快数据库搜索工具，用于基于质谱的蛋白质组学中的肽鉴定。它在广泛的数据集和应用程序中展示了出色的性能。MSFragger 适用于标准鸟枪法蛋白质组学分析以及大型数据集（包括 timsTOF PASEF 数据）、酶无约束搜索（例如肽组）、开放数据库搜索（例如，前体质量耐受性设置为数百道尔顿），以识别修饰肽，和糖肽鉴定（N-连接和 O-连接）。

pFind: Open-pFind 可以在超大的搜索空间中高效地识别多肽，该搜索空间考虑了意外修改、氨基酸突变、半特异性或非特异性消化和共洗脱多肽。

Skyline: Skyline 是一个免费提供的开源 Windows 客户端应用程序，用于构建选择反应监测 (SRM)/多反应监测 (MRM)、平行反应监测 (PRM)、数据独立采集 (DIA/SWATH) 和 DDA，采用 MS1 定量方法和分析产生的质谱仪数据。它旨在采用尖端技术为生命科学中的大规模定量质谱研究创建和迭代改进目标方法。

OpenSWATH: OpenSWATH 工作流程可对数据独立采集 (DIA) 或 SWATH-MS 蛋白质组数据进行有针对性的数据分析。主要工作流程包括 OpenSWATH、PyProphet、TRIC、IPF 和 TAIR。该网站提供有关工具安装和应用的文档。

Spectronaut: Spectronaut软件是蛋白组DIA分析最常用的谱图解析软件之一，优点是定量准确，缺点是高额收费，window版本，速度慢。

DIA-NN: DIA-NN - Demichev、Ralser 和 Lilley 实验室用于数据独立采集 (DIA) 蛋白质组学数据处理的通用软件。2018 年，DIA-NN 开启了蛋白质组学的新篇章，引入了许多算法，使用高通量方法实现了可靠、稳健和定量准确的大规模实验。