RNA-seq差异分析究竟应该用什么？

一般来说，我们在RNA-seq进行差异分析时最好使用Count值，因为limma-voom、edgeR和DESeq2都是针对RNA-seq的Count值分布进行假设，从而设计的软件。但是，在实际过程中，我们并不是总能获得其Count值，而经常得到的是FPKM或者TPM值，那对于这种情况，我们能不能使用类似于分析芯片的方法进行差异分析呢？

和前面一样，使用的数据依然来自GSE145894，使用STAR进行比对，然后使用StringTie获取其Count值和FPKM以及TPM值。对于Count值，使用DESeq2，而对于FPKM值，在log2之后使用limma进行差异分析。为避免固定阈值导致的误差，我使用mean(logFC)+2*sd(logFC)作为差异阈值，以P<0.05作为显著性阈值。

下面，进入我们的正题部分。

1、Count值

logFC_t约为4.2，共有665个基因下调，196个基因上调。

2、FPKM

logFC_t约为0.7，共有112个基因下调，305个基因上调。

3、筛选后的FPKM值

以去除全0行作为筛选条件。

logFC_t约为0.9，共有82个基因下调，268个基因上调。

4、经过四分位标准化后的FPKM

logFC_t约为0.7，共有392个基因下调，255个基因上调。

5、筛选后并经过四分位标准化后的FPKM

logFC_t约为0.6，共有436个基因下调，333个基因上调。

看起来已经有很大的差异了，那么具体有多少差异基因具有一致性呢？做个upset图看看。

这差异也太大了吧。。。。

虽然这只是一个孤证，但是也能够提醒我们在分析数据的时候注意，如果能拿到原始count，还是用count来做吧。同时也说明，即使有FPKM和TPM值，也不能简单地log之后用芯片的方法进行差异分析。