人胸腺基质的单细胞转录谱揭示胸腺髓质中新的细胞异质性

前言

题目：Single-cell transcriptional profiling of human thymic stroma uncovers novel cellular heterogeneity in the thymic medulla 日期：2021-02-17 期刊：Nature Communications 链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-21346-6

摘要

胸腺是一个重要的初级淋巴器官，支持多样化、自我耐受的外周 T 细胞的发育。在出生后胸腺中发现的主要基质细胞是胸腺上皮细胞 (TEC)、间充质、内皮细胞和非淋巴造血细胞（树突状细胞和巨噬细胞）。皮质 TECs (cTECs) 负责 T 谱系定型和早期胸腺细胞的阳性选择，而髓质 TECs (mTECs) 参与自身反应性细胞的缺失和胸腺细胞成熟的最后阶段。

最近的证据表明，胸腺基质由功能上不同的亚群组成，但人类胸腺中这种细胞异质性的程度尚不清楚。文章使用单细胞转录组测序来全面分析跨生命多个阶段的人类胸腺基质。间充质、周细胞和内皮细胞被确定为胸腺上皮细胞分化和胸腺细胞迁移的潜在关键调节因子。

人胸腺基质细胞的单细胞分析

为了识别构成人类胸腺微环境的不同细胞类型，作者对从胎儿、出生后和成人组织中分离的基质细胞进行了 scRNA-seq。通过酶消化胸腺组织获得基质细胞，然后使用磁珠或基于荧光激活细胞分选 (FACS) 的 CD45 阴性细胞纯化耗尽 CD45 阳性免疫细胞，从而导致EpCAM + CD45 -上皮细胞和 EpCAM - CD45 -非上皮基质细胞的富集。

这里是从两个胎儿（19 和 23 孕周）、两个产后（6 天和 10 个月大）和一个成人（25 岁）样品中分离的细胞，使用 BBKNN进行过滤和批量校正之后，最终得到68,008 个细胞，确定了12个细胞群。

鉴定了三种上皮细胞（EPCAM和KRT8作为一般上皮标记物和FOXN1、PSMB11、LY75、CLDN4、AIRE、IVL, NEUROD1 , MYOD1作为特定亚群的标志物), 一种间叶细胞 ( PDGFRA, LUM, LAMA2 ), 一种周细胞 ( PDGFRB, MCAM, CSPG4也称为NG2 ), 一种血管动脉内皮细胞 ( PECAM1 , VEGFC , GJA4 ), 两种血管静脉内皮细胞（PECAM1、ACKR1、SELE、APLNR）、一种淋巴管内皮细胞（LYVE1、PROX1、CCL21）、一种红细胞（GYPA、HBA1、HBG1）、一种免疫细胞（PTPRC、CD3D、CD7）和一种间皮细胞（MSLN，UPK3B，PRG4）。

神经嵴、间充质和内皮细胞对于通过产生可溶性因子和细胞间相互作用来支持胸腺生成的胸腺微环境的建立很重要。但是这些可溶性因子在人类胸腺发育中的功能和细胞类型特异性尚不清楚。为此分析了 WNT、BMP、转化生长因子 β (TGFβ)、胰岛素样生长因子 (IGF) 和成纤维细胞生长因子 (FGF) 的可溶性因子和受体的表达信号。

图f发现，间充质细胞表达关键途径的许多配体和调节剂，包括WNT5A、RSPO3、SFRP2、IGF1和FGF10，而这些因子的受体（ROR1、ROR2、RYK、IGF1R和FGFR2）是在上皮细胞中发现。内皮细胞还表达细胞外基质和粘附分子，如纤连蛋白 ( FN1 ) 和LGALS3，它们已被证明可调节胸腺细胞迁移。上皮细胞和间皮细胞富含许多 WNT 配体，而间皮细胞也表达 WNT 信号调节剂（ RSPO1、 RSPO3、 SFRP2、 SFRP5）和BMP4。周细胞表达FRZB以及WNT6、 BMP5和FGF7。有趣的是，编码激活素 A ( INHBA ) 亚基的基因最近被证明对 TEC 分化很重要，几乎完全由周细胞表达。相比之下，促进 TEPC 维持并抑制分化6的激活素拮抗剂卵泡抑素 ( FST )主要存在于成人间充质细胞和上皮细胞亚群中。

值得注意的是，图g中BMP4、FGF7（也称为 KGF）和分泌的 WNT 抑制剂相关蛋白FRZB与胎儿间充质相比，在出生后和成人间充质细胞中表达更频繁，表明TEC分化和增殖随着时间的推移受到间充质因子的差异调节。

以上分析表明，人类间充质、内皮细胞和周细胞可能通过提供对 TEC 发育至关重要的因子或通过调节造血祖细胞迁移的趋化因子和粘附分子的表达，在支持胸腺生成中发挥互补的作用。

人类胸腺上皮细胞在不同阶段的分析

将上图d中的3群上皮细胞继续细分亚群，得到9个亚群，基于已知 TEC 的biomarker和差异基因注释得到：

• 两个亚群表达了 cTECs 的特征基因（PSMB11、PRSS16、CCL25）。cTEC lo这群中的细胞表达较低水平的功能基因（HLA II 类、 PSMB11、PRSS16、CCL25) 并含有更多的 KI67+-增殖细胞
• mTEC lo（CLDN4，较低水平的 HLA II 类）
• mTEC hi（SPIB、AIRE、FEZF2，较高水平的 HLA II 类）
• 角质细胞样 mTEC（KRT1、IVL ）
• immature TEC表达典型的 TEC 基因（ FOXN1、 PAX9、 SIX1）但缺乏 cTECs 或 mTECs 的功能基因
• 神经内分泌（BEX1、NEUROD1）
• 肌肉样肌样（MYOD1、DES）
• 髓鞘+上皮细胞（SOX10、MPZ）

在成人胸腺中检测到的 cTEC 或 mTEC hi非常少，表明存在不成熟 TECs 的积累，损害了旧组织中的功能性 TECs。这个假设得到了免疫荧光分析的支持，显示髓质中的 AIRE+mTEC hi数量减少（图 f）以及较老组织中缺乏 TECs 的大皮质和髓质区域（图g）

进一步研究immature TEC

继续将immature TEC分为2个亚群：immature TEC-1（未成熟 TEC-1）和immature TEC-2（未成熟 TEC-2）。

与胎儿和出生后组织相比，一些富含未成熟 TEC-2 的基因（IGFBP5、NNMT、MAOA、DPYS、FKBP5、GLUL）在成人细胞中的表达明显高于胎儿和出生后组织。非典型钙粘蛋白基因CDH13也在未成熟的 TECs 中富集，并且在 TECs 中的表达通过免疫荧光在蛋白质水平上得到证实。

胸腺上皮室内的谱系发育

为了更好地了解不同上皮亚群之间的关系，作者分析 RNA速率 进行了拟时序分析。

分别分析了胎儿、出生后和成人样本，结果表明，在胎儿和出生后组织中都产生cTECs lo到 cTECs hi的转变

鉴于 Notch 信号在调节其他组织谱系选择中的关键作用，作者看了参与该途径的基因的表达，包括配体、受体、靶基因和抑制剂。发现DLL4是促进 otch1-dependent T 细胞成熟的关键配体，而JAG2是在 cTECs 中表达的主要配体，而JAG1在未成熟的 TECs 和 mTECs 中检测到。

重要的是，三种受体（NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3）和它们的许多靶基因（HES1、HES2、HES4、HEY1和NRARP) 在 mTECs 中以更高水平表达，表明 Notch 信号在 mTECs 中比 cTECs 更活跃。免疫荧光分析表明在 KRT15 + TECs 中检测到 HES1 蛋白，证实 Notch 信号在这些 TECs 中是活跃的。在 cTECs中也检测到了Notch 抑制剂DLK1 ，而在未成熟的 TECs 中发现了DLK2，这意味着在这些细胞中 Notch 信号传导减少。最后，HES6 的表达，HES1的负调节因子，在神经内分泌细胞和肌样细胞中显著升高，表明 Notch 活性在这些上皮亚群中被阻断。