人乳腺癌中成纤维细胞的异质性和免疫抑制微环境研究

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文章题目：Fibroblast Heterogeneity and Immunosuppressive Environment in Human Breast Cancer 期刊：Cancer Cell 日期：2018年3月 DOI: https://doi.org/10.1016/j.ccell.2018.01.011

摘要

癌相关成纤维细胞 (CAF) 是肿瘤微环境中的关键参与者。在这里，我们表征了乳腺癌中具有不同特性和激活水平的四个 CAF 子集。两种肌成纤维细胞亚群（CAF-S1、CAF-S4）在三阴性乳腺癌（TNBC）中量的不同。CAF-S1 成纤维细胞通过多步骤机制促进免疫抑制环境的形成。通过分泌 CXCL12，CAF-S1 吸引 CD4+CD25+ T 淋巴细胞并被 OX40L、PD-L2 和 JAM2 保留。此外，CAF-S1 通过 B7H3、CD73 和 DPP4 增加 T 淋巴细胞存活率并促进其分化为 CD25HighFOXP3High。最后，与 CAF-S4 相比，CAF-S1 增强了调节性 T 细胞抑制 T 效应子增殖的能力。这些数据与富含 CAF-S1 的 TNBC 中 FOXP3+ T 淋巴细胞的积累一致，并显示了 CAF 亚群如何促进免疫抑制。

结果

流式分选指标，CD45-, EPCAM-, CD31-，去除血细胞、上皮细胞、内皮细胞；成纤维细胞的分群指标： FAP, integrin b1/CD29, aSMA, S100-A4/ FSP1, PDGFRb, CAV1。下图是流式分选和鉴定的结果（图A-C）。图D是CytoSPADE分析流式数据来进一步证明这个分群的合理性。

分群结果是

• CAF-S1: CD29Med FAPHi FSP1Low-Hi aSMAHi PDGFRbMed-Hi CAV1Low;
• CAF-S2: CD29Low FAPNeg FSP1Neg-Low aSMANeg PDGFRbNeg CAV1Neg；低表达或者不表达这六个marker
• CAF-S3: CD29Med FAPNeg FSP1Med-Hi aSMANeg-LowPDGFRbMed CAV1Neg-Low;
• CAF-S4: CD29Hi FAPNeg FSP1Low-Med aSMAHi PDGFRbLow-Med CAV1Neg-Low.

四个亚群的表征

先通过染色并量化看了这四个群在三种不同分型乳腺癌中（ LumA, HER2, TNBC）的分布。如下图A-C.图D 是作者的染色分群标准。

根据图D的标准，研究者得到各分型的细胞亚群比例，见下图E。LumA富集了CAF-S2,HER2富集了CAF-S4, 而TN 两者都不富集。作者又做了图F的PCA分析和图G 的细胞类型可视化。结论是不同乳腺癌类型的CAF亚型数量、空间分布不一样

CAF-S1 主要和FOXP3 淋巴细胞的积累有关

分别研究不同亚群的功能。主要分析CAF 与免疫浸润的关系。发现CAF-S1与CD45+免疫细胞正相关， 与CD4+和CD8+ T 细胞负相关，见下图图A。与CD8+ T细胞的负相关在TN 组别中更明显。筛选了肿瘤细胞分泌的因子，发现CAF-S和 (IL-17F), IL-1b, IL-10, IL-6等正相关（下图B）。接着做了的免疫组化染色来验证（图C-J）。也就是说 CAF-S1富集的TNBC T 细胞浸润程度更高，同时CD8+ T细胞的减少可能影响TN乳腺癌的预后。

CAF-S1,CAF-S4 的分子水平表征

流式分选出这两个细胞亚群，做RNA测序。选取前500个不同的基因做聚类。图A可以看到不同癌型的CAF-S1 聚类到一起了。通过对文献的综述CAF相关的信号通路分子，mapping到图D 。鉴定出CAF-S1高表达的基因，在免疫调节方面有作用。主要涉及到的细胞因子 CCL11, CXCL12, CXCL13, 和 CXCL14), 细胞粘附 (JAM2) 免疫调节功能(TNFSF4/OX40L, PDCD1LG2/PD-L2, DPP4, NT5E/CD73, 和 CD276/B7H3。

CAF-S1 成纤维细胞促进CD4+CD25+ T细胞的 聚集和滞留

CAF-S1 富集的间质 有更多的FOXP3+T细胞。transwell 实验发现CAF-S1促进CD4+CD25+ T细胞的迁移。图 B比较了CAF-S1.CAF-S4差异表达的趋化因子。其中发现CXCL12促进T 细胞迁移的效果最明显。CAF-S1中 CXCL12沉默后，吸引到T细胞显著减少。图E-I ，将两种细胞共培养并观察。研究者首次检测到两种细胞很近，表明CAF-S1 吸引到T细胞。

CAF-S1 促进调节T细胞分化和活性，CAF-S4 没有这些功能

接着看到CAF-S1,CAF-S4 对 CD25+FOXP3+ T 分化的影响。CAF-S1增加了CD35+细胞中CD25+FOXP3+ T细胞亚群。CAF-S4没什么影响。CD276/B7H3, NT5E/CD73, 和 DPP4在CAF-S1中高表达，在CAF-S4中没有（图C）。沉默了OX40L后对CD25+FOXP3+ T细胞没影响（图D-F）。CD73 和DPP4只对FOXP3 high 细胞群影响大，而B7H3 对FOXP3 med 和FOXP3high 有影响。CD25HighCD127lowCD45RAlow T细胞核CAF-S1 共培养后，提高了其对CD4+CD25- 细胞增殖的抑制。CAF-S4则没有这样的效果。

总结

主要用流式分选的方法分出四个细胞亚群。CAF-S1 在免疫抑制过程中有重要角色。CAF-S1能吸引CD4+CD25+ T细胞并促进其分化为CD25+FOXP3 细胞。