人—气道组织单细胞悬液制备

组织背景介绍

气管是人体进行呼吸的通道，气管与支气管连接于喉与肺之间，属于下呼吸道。气管自分杈处分为左、右主支气管，其管壁由内向外依次分为黏膜、黏膜下层和外膜3层。黏膜由上皮和固有层组成，上皮为假复层纤毛柱状上皮，由纤毛细胞、杯状细胞、基细胞、刷细胞和小颗粒细胞组成。黏膜下层为疏松的脂肪结缔组织，含血管、淋巴管、神经和较多的气管腺。气管和支气管的外膜由16-20个C形的透明软骨环和疏松结缔组织构成，软骨环之间以弹性纤维构成的膜状韧带相连接，共同构成管壁的支架

支气管结构与气管相似，由软骨环、结缔组织与平滑肌组成，支气管进入肺门后，如树枝状反复分支，形成支气管树，此时分支愈分愈细，软骨环数目逐渐减少，软骨环也不完整。

本次解离中，使用了枯草杆菌蛋白酶。该酶适用于碱性环境，是一种内切酶，催化部位为丝氨酸。

气道组织示意图

材料和试剂耗材

1、仪器耗材

2、酶混合溶液

实验流程

1. 取样后将组织放入预冷的解离缓冲液中，并保存在4℃。
2. 用大口径1 mL 移液器吸头，小心地从解离缓冲液中取出活检组织，放入100mm培养皿中，并加入少量解离缓冲液。
3. 将组织切碎成尽可能小的碎片，用移液器将切碎的活检组织与少量解离缓冲液一起转移至离心管，并用解离缓冲液冲洗培养皿（重点为组织切块的位置）以尽可能多的转移细胞。
4. 在冰上孵育90 -120min，每5min轻轻研磨5次。
5. 添加200 μL灭活缓冲液（含有2% BSA的HBSS）灭活蛋白酶。
6. 4°C下400g离心5min，弃上清，留10μL残留液体。
7. 用100μL洗涤缓冲液（HBSS + 1% BSA）重悬沉淀。
8. 在倒置显微镜下观察细胞以评估红细胞（RBC）含量。如果红细胞含量低于50%，则直接进行第13步，如果红细胞含量较多，则需进行红细胞裂解。
9. 加900µL 氯化铵 0.8% 到100µL 细胞悬浮液，在冰上孵育10min后，添加200μL灭活缓冲液。
10. 4°C下400g离心5min，弃上清，留10μL残留液体。
11. 用100μL 洗涤缓冲液重悬，并在显微镜下监测红细胞。
12. 添加1mL洗涤缓冲液
13. 4°C下400g离心5min，弃上清，留10μL左右残留液体
14. 在500μL 的洗涤缓冲液中重悬，通过 Flowmi 细胞过滤器（40μM）过滤细胞悬液
15. 在过滤后的细胞中加入500μL洗涤缓冲液。
16. 弃上清，留下10μL残留液体。
17. 用40μL重悬缓冲液（HBSS + 0.05% BSA）重悬
18. 使用台盼蓝和细胞计数器进行细胞计数并计算存活率。对于10X，将浓度调整到700 -1000个细胞/μL（使用洗涤缓冲液）范围内，监测最终细胞浓度

结果展示