相位相关TMS对脑电皮层运动网络的影响

已有研究对经颅磁刺激(TMS)应用于大脑振荡，观察磁刺激对大脑状态的影响。然而，没有人研究相位相关的TMS是否可能调节属于同一网络的同源远端脑区连接。在网络靶向TMS的框架下，我们研究了对持续的大脑振荡的特定相位的刺激是否有利于刺激目标的远端网络节点出现更强的皮质-皮质(c-c)同步。在24名健康个体的实验中，TMS脉冲刺激刺激初级运动皮层(M1)，间隔1个月，重复两次。考虑到TMS脉冲是在μ频率振荡的正(峰)或负(谷)相位时发出，刺激效应取决于在感觉运动网络的同源区域内c-c同步。扩散加权成像(DWI)用于研究感觉运动网络中的c-c连接，并识别与刺激点连接的对侧区域。根据应用TMS脉冲的时间(峰或谷)，其对脑内神经网络同步性的影响有明显的变化。研究发现，谷刺激试次与峰值刺激试次相比，在μ频带进行TMS脉冲后(0-200ms)的M1-M1相位锁值同步更高。本文发表在The Journal of Physiology杂志。

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1. 引言

在过去的二十年中，经颅磁刺激(TMS)已被广泛用于治疗一些神经和精神疾病。经颅磁刺激的研究结果往往显示出很高的可变性，有时效果很小，反映的只是临床改善。众所周知，TMS脉冲对神经系统的影响不仅取决于刺激的性质，还取决于受扰动区域的初始大脑状态。大脑状态可以通过脑电图(EEG)进行无创测量，潜在的皮层活动可以通过持续振荡来表征。一种探索这种振荡的神经生理学意义的令人信服的方法是结合TMS和EEG。事实上,由TMS脉冲引起的定时扰动的影响可以通过EEG来测量，从而评估对大脑活动的局部诱导和刺激对整个大脑的毫秒水平的传播。也有可能研究特定大脑状态对TMS刺激所诱发的效应的影响，并将其与认知或行为结果联系起来。出于这个原因，在过去的几年里，为了将几种疾病的治疗个体化，对自发性脑振荡和神经兴奋性对经颅磁刺激干预的可变性的影响进行了研究。在这一背景下，最近的研究已经开始在预先设定的脑振荡期传递单个或一系列外部脉冲。具体地说，就是在感觉运动区域μ频带(8-13Hz)的负峰(谷)期间应用相位依赖TMS。

尽管一些研究评估了相位依赖的TMS应用后的行为和脑诱发电位的结果，但迄今为止还没有研究属于同一网络的同源脑区c-c同步的变化。在本研究中，我们使用影像引导的TMS-EEG选择性地干扰初级运动皮层(M1)，并进一步研究c-c连接是否受到感觉运动皮层μ节律相位的调节。鉴于之前的研究已经证明了μ节律的波谷是如何代表一种高兴奋状态的，我们假设，相对于峰值刺激，负峰处的外部扰动能够诱导受刺激靶区和同一网络中相应区域之间更高的c-c同步。

最后，进行了控制分析，以研究白质的微观结构特性是否与c-c同步化有关。重要的是，考虑到数据的可重复性，在两个不同的研究中，对同一健康个体样本收集的数据进行了相同的分析，间隔一个月。

2. 被试和方法

选取了24名被试。TMS前的MRI评估综合进行了T1加权(T1w)解剖、静息状态fMRI和DWI扫描。这样的成像评估是为了提取个性化的网络地图(图1A)。每个参与者随后进行两次TMS检查，间隔一个月，在M1脑区上每5-8秒(随机)进行120次单脉冲(图1B)。根据个体静息运动阈值(RMT)对TMS进行个性化处理。

图1 数据分析流程。

(A)为了识别对侧运动网络，利用Freesurfer软件实现的球形配准，将7个网络功能皮层图谱投影到受试者皮层表面。

(B)TMS应用于个体左侧初级运动区(M1)。

(C)采用SimNIBS模拟TMS诱导的电场。然后定义最大电场点(E-field)，从那里创建一个半径为0.5cm的球体。

(D)基于种子解剖约束的示踪成像是为了外推连接电场点图和对侧感觉运动网络的白质束。

(E)提取离刺激点最近的电极的时间序列，并进行滤波。然后根据TMS脉冲是在正峰还是在负峰分别将试次分为峰和谷。为了研究结果在多大程度上取决于TMS脉冲与相位的实际峰值的距离，我们使用从5ms(非常精确)到40ms(更自由)的几个灵敏度窗口，将TMS刺激分为落在峰或谷。

(F)源水平的连通性分析，从连接刺激灰质部分的白质纤维末端提取指标。

(G)使用相位锁定值(PLV)为分析的连通性度量。

模拟和图像引导电极的选择

为了进行c-c（皮质-皮质）连通性分析，根据电场(E-field)建模(左半球)和示踪成像(右半球)，选择TMS脉冲主要影响的灰质部分。采用SimNIBS模拟TMS诱导的电场来识别直接受外部扰动影响的皮层区域(图1C)。鉴于在文章中对如何选择性地识别只被经颅磁刺激脉冲影响的大脑区域没有达成共识，从而我们定义以最大电场创建一个半径0.5厘米的球体，用作连通性分析种子的源空间。在电极水平分析方面，计算受刺激半球各电极的欧氏距离，选取距离阈值电场质心最近的电极进行连通性分析。接下来，为了识别对侧运动网络，利用Freesurfer软件实现的球形配准，将7种网络的皮层功能图谱投影到受试者皮层表面(图1A)。然后将得到的图谱重新采样到核磁共振成像中。基于种子解剖约束的示踪成像是为了外推连接电场点图和对侧感觉运动网络的白质束(图1D)。

实验和分析过程

首先，根据TMS脉冲是在正峰还是在负峰分别将试次分为峰和谷。为了研究结果在多大程度上取决于TMS脉冲与相位的实际峰值的距离，我们使用从5ms(非常精确)到40ms(更自由)的几个灵敏度窗口，将TMS刺激分为落在峰值或低谷。提取离刺激点最近的电极的时间序列，并进行滤波。具体来说，如果脉冲落在持续振荡的峰值或低谷的灵敏度窗口内(即±5ms)，则将其归类为落在峰值或低谷上。例如，如果使用的窗口大小为5ms，当且仅当脉冲在正(或负)相位峰值附近±5ms时，试次被划分为峰(或谷)。

随后对脑电数据进行了源重建，为了研究谷、峰试次的半球间c-c同步差异，从不同频率(3Hz-40Hz)下的个体电场阈值图计算全脑锁相值(whole-brain Phase Locking Value,PLV)。随后进行了基于相位的脑电连通性分析。为了研究在源水平上发现的连通性结果是否也可以在电极水平上复制(图1G)，还计算了受TMS脉冲影响的电极之间的PLV。最后进行DWI指标计算。

3. 结果

左右半球之间的源水平相位连接

为了研究运动网络内的c-c同步，使用阈值电场图作为种子分别计算源水平PLV图。如图2A所示，谷试次对侧躯体运动网络个体μ波段的PLV值高于峰试次。如图2B所示，个体PLV得分在低谷试次中显著高于高峰试次。

图2 源水平PLV结果：

(A)对波谷试次和波峰试次的PLV图进行显著的聚类比较。在第1次实验(上)和第2次实验(下)中，受刺激区域和对侧半球之间的同步性更高。

(B)与峰试次相比，谷试次具有更高的同步性。

电极选择和波谷/波峰比

在受刺激半球(图3A左)，最接近阈值电场图质心的电极为C3，C1，FC1，FC3和C5。在对侧半球(图3A右侧)，电极最接近白质纤维的终端的电极为C4、FC4、C2、CP4、FC2、C6和P4。

对于峰谷比(图3B)，我们发现在试次细分中，无论敏感度的时间阈值如何，比值都在1左右，这意味着峰谷试次的次数相同。

左右半球之间的电极水平相位连接

对于试次中5ms的灵敏度阈值(图3C)，时频PLV在μ波段波谷进行TMS脉冲刺激后所选电极与波峰试次相比具有更大的同步。

图3 灵敏度阈值为5ms时的时频PLV结果

(A)在大多数受试者和整个实验中，受TMS脉冲直接影响最多的电极是受刺激半球的C3和对侧半球的C4。

(B)在试次分割选择中，考虑到不同程度的时间敏感性(从无约束到最小5ms窗口)，将试次分为峰或谷的比例。

(C)所示为灵敏度阈值为5ms时的时频PLV。原始差值图表示波谷试次与波峰试次之间的差值。然后将波峰和波谷的时频矩阵转换为z值(z-map plot)，并根据替代条件差值的空分布进行统计。最后，在无条件差的零假设下，计算连续显著点的聚类大小分布，只保留超过该分布第95个百分位的时频聚类。波谷试次观察到，与实验1和实验2的峰值试次相比，电极之间存在更大的同步。

有趣的是，这个结果独立于用来细分试次的时间敏感性阈值(图4)。图4：给出了波谷试次和波峰试次中不同灵敏度阈值的时频PLV。对于两次实验，结果基本一致。

图4 不同时间灵敏度阈值情况下波谷和波峰实验PLV结果差异

对照分析

为了测试实验1和实验2的峰/谷比的电位差，使用实验(2个水平:实验1和实验2)和时间(5个水平:40ms、30ms、20ms、10ms、5ms)进行2x5方差分析。发现并没有明显差异。此外，为了控制TMS诱导的c-c相位连接在谷试次中的特异性，分析了在睁眼时采集的3分钟静息状态脑电图。具体来说，在数据预处理后，与TMS诱发数据相比，建立了具有时间窗的代分段。然后，提取同一电极的时间序列，并使用相同方式进行滤波。然后，根据替代数据是否分别发生在正的或负的峰值时，将试次分为高峰或低谷。在峰谷试次中，计算静息状态和TMS-EEG数据之间的拓扑余弦相似度。此外，对于峰谷试次，还提取了TMS前静息期(−500ms至0ms)的c-c连通性，并与TMS后窗口进行了比较。我们假设，与传统的静息态脑电图相比，TMS会在结构连接的脑区之间诱导更高的c-c同步，特别是在谷试次中。

如图5A所示，无论是使用静息状态数据集还是TMS-EEG数据集，EEG试次分类都是可靠的。众所周知，在存在TMS相关的(残留)伪影和诱发反应的情况下，正确识别相位具有挑战性，但这种TMS诱导的信号污染并不会影响对试次进行准确分类的总体能力。如图5B所示，在2x2x4方差分析中，TIME*FREQUENCY和TIME*TRIAL交互显著。事后比较显示，这种模式是由波谷试次驱动的，在Theta和Alpha频段发现了显著差异。

图5 对照分析：

(A)利用静息状态睁眼时采集的脑电图数据进行峰谷试次分类。得到的地形图显示了与TMS-EEG数据相比较的模式，这表明TMS相关(残差)伪影并不会影响对试次进行精确分类的总体能力。

(B)在TMS前和TMS后的时间窗口中提取的所有频率的PLV的全脑均值。波谷试次与波峰试次相比，在Theta和Alpha频带中发现了显著差异(红色方框)。

DWI度量与同步的关系

使用MRtrix3Tissue计算每个参与者的白质纤维定向分布(FODs)，通过单壳3组织约束球形反褶积‖(SS3T-CSD)，使用每种组织类型(白质(WM)、灰质(GM)和脑脊液(CSF))的组平均响应函数。按照这些处理步骤，我们为FBA计算了三个标准的度量：

纤维密度(FD)：作为轴突密度或堆积的代理的一种微观结构指标;

纤维截面(FC)：一个宏观结构度量，近似于相对纤维束直径或大小;

纤维密度和截面(FDC)：FD和FC的产物，微观和宏观结构的变化。

为了研究μ波段和脑结构中显著的谷峰同步之间的关系，我们将个体PLV作为因变量，FD、FC或FDC作为自变量，分别进行非参数置换GLM分析。如图6所示，对于连接初级运动皮质的经胼胝体纤维，峰谷试次的同步量与FDC度量之间存在显著的正相关。

图6 皮质-皮质同步化的微观结构预测因子：峰谷试次的同步量与FDC指标之间存在显著的正相关(p < 0.05，经fwe校正)。

4. 讨论

先前的研究已经研究了TMS是如何与自发脑振荡相同步的，从而在大脑和行为水平上导致受刺激神经回路的兴奋性的长期变化。在这里，我们进一步扩展了这一概念，展示了在持续μ振荡到达负峰值时外部扰动如何能够在受激区域和属于同一网络的对侧同源区域之间诱导更强的c-c同步。研究结果与大脑其他非运动网络的参与和耦合特别相关。最后，受激白质束的微观结构性质与同步量显著相关，表明当外界扰动传递时，无论相位如何，轴突特性都与动作电位的传播有关。

波谷TMS诱导皮质-皮质同步化

根据我们的假设，与自发μ振荡的正峰相比，外部扰动在自发μ振荡的负峰处产生了更高的c-c（皮质-皮质）同步性。此外，我们的对照分析表明，这种结果是特定于theta和alpha频段的，重要的是，它不是由跨条件的c-c同步值在TMS前的差异驱动的。先前在大鼠上的单细胞记录显示，受刺激的锥体细胞主要在负相放电。在这一框架下，最近的人类TMS-EEG研究了与MEPs和TEPs振幅测量的μ振荡的正峰相比，皮质兴奋性在负峰时是如何增强的。事实上，在TMS诱导的电场建模之后，手部运动区域的外部扰动会激发平行于磁场的中央前和中央后回中的纤维。这种输入导致锥体细胞顶端树突的跨突触激活，这被认为是表面脑电图负偏转的主要发生原因。因此，在μ节律负峰时的外部扰动会在锥体细胞接近放电阈值时到达其树突，导致其被吸收的比例更高。在这种背景下，我们的回顾性分析提供了第一个证据，表明刺激诱导的目标脑网络中的连通性变化取决于刺激时正在进行的内源性脑振荡的相位。根据上述生理学研究，我们已经证明，在源水平上，μ振荡的脑电图负峰代表了在同一网络的同源脑区诱发更高的c-c连通性的相位瞬间，这不仅仅是之前所证明的皮质脊髓神经元的高兴奋状态。重要的是，与基于源的重建相比，虽然在电极水平上的空间分辨率较低，但是得到了相同的结果。这种方法克服了个体模式的基本限制，并有可能扩展到其他认知领域，在这些领域中，大脑解剖和几何形状的变异性更高。

总的来说，与经颅磁刺激的状态依赖效应相一致，我们的发现表明，一个给定的刺激对大脑的影响高度依赖于那一刻的大脑振荡相位，而不仅仅是刺激本身的性质。因此，考虑到经颅磁刺激治疗脑功能紊乱的结果具有高度可变性，未来的研究应该测试刺激是否与患者个体的瞬时大脑状态同步，从而改善干预的结果。

皮质-皮质同步化的神经预测因子

除了估计给定干预措施的影响外，识别特定特征，预测对给定治疗或治疗的高或低反应可能性，在临床和非临床环境中变得至关重要。我们强调了一个非常有趣但初步的预测因子，即TMS在纤维FDC中诱导的c-c同步。几项研究报告了连接双侧初级运动皮层的纤维束的微观结构与半球间抑制强度之间的正相关关系，这是在患有短期半球间抑制的成年人中测量到的。

在这个框架中，我们的研究结果表明，连接两个初级运动皮层的白质束的微观结构特性(轴突密度和束大小)与同步化呈线性相关。在峰谷试次中都发现了这样的结果，这一事实可能表明，外部扰动会使相同的神经元群体和白质纤维参与。相反，当TMS脉冲被应用时，白质束所传递的信息量高度依赖于相位。这些结果需要进行因果检验。

研究的局限性和未来的发展方向

脑电图存在低空间分辨率的问题。尽管我们选择的电极是基于高空间分辨率DWI采集获得的个体白质束筛选的，但如果理想地将TMS-EEG与同时采集的fMRI结合起来，将能更好地捕获TMS诱导的网络效应的更精确的空间映射。对于时频脑电图分析，一个重要的局限性是我们还没有测试其他频段振荡的c-c连通性的电位变化。然而，μ振荡的选择是基于之前的研究，而其他振荡频带的结果被证明是矛盾的。

此外，在弥散信号方面，未来的研究可能采用MRI定量技术结合先进的生物物理模型，测量白质的微观结构特征，如轴突直径和整体神经束长度。此外，未来的研究应结合扩散和功能MRI来约束脑电反问题的分辨率，以评估脑白质在毫秒尺度上的信息传递。

最后，未来的研究应进一步探讨TMS的这种相位依赖效应是否可以扩展到其他参与高级认知功能的静息态网络。