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社区首页 >专栏 >10x单细胞测序技术揭示肝脏细胞全景图

10x单细胞测序技术揭示肝脏细胞全景图

作者头像
生信技能树jimmy
发布于 2020-03-30 13:53:51
发布于 2020-03-30 13:53:51
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文章被收录于专栏:单细胞天地单细胞天地

呐,等你关注都等出蜘蛛网了~

不知不觉在单细胞转录组领域做知识分析也快两年了,很幸运聚集了五个小伙伴携手共进,我们承诺不间断更新5个月,把我们这两年的学习成果全部掏出来给大家,包括5个栏目:

  1. 文献速递(简短介绍,扩充知识面)
  2. 文献详解(图文并茂带来大家系统性学习)
  3. ř与Bioconductor的技巧(书籍翻译,妙招共享)
  4. scRNAseq的GitHub的书籍翻译(原汁原味的名校教程)
  5. 全网第一个单细胞转录组视频教程学习笔记分享

现在你看到的是文献速递

希望大家能有所收获!

文章信息

今天给大家介绍的文献发表于2018年10月的Nature Communication上,题目是:“Single cell RNA sequencing of human liver reveals distinct intrahepatic macrophage populations” ,是关于单细胞测序在发育研究中的应用。

文章总览

肝脏是人体内最大的实体器官,对代谢和免疫功能至关重要。然而人们对构成人体肝脏的细胞类型和免疫微环境知之甚少。作者使用10x单细胞RNA测序手段绘制了人类肝脏细胞全景图,从来自五个人新鲜肝脏组织中分离得到的8444个实质和非实质细胞转录谱。通过鉴定每群细胞的差异表达基因(DEG),并使用已知的标志性基因、流式细胞术以及人肝组织的免疫组织化学染色技术,作者鉴定到了20个离散的细胞群,包括肝细胞、内皮细胞、胆管细胞、肝星状细胞、B细胞、常规和非常规T细胞、NK样细胞和不同的肝内单核细胞/巨噬细胞群,两个不同的驻留巨噬细胞群具有炎性和非炎性/免疫调节功能,这些结果揭示了肝脏免疫生物学特性。

背景知识

肝脏对人体新陈代谢和免疫功能至关重要。单细胞分辨率的健康人肝脏细胞全景图对于理解肝病的发病机制和治疗至关重要。但是这种全景信息很难获得,主要是因为新鲜的人体肝脏组织很难获得,组织很难分割,其中一些脆弱的常驻细胞群很容易被破坏。因此本文一是应用作者以前开发的肝脏组织解离技术来分离肝脏组织,二是使用单细胞转录组测序技术(scRNA-seq),结合两者来绘制正常人肝脏细胞全景图。scRNA-seq技术是描述高度异质性细胞群体的有力工具,但是该技术尚未被广泛使用于绘制整个人体器官图谱。

样本

神经死亡的五个捐赠者正常肝脏组织

10x样品处理和cDNA文库制备

将组织破碎获得悬浮细胞溶液后,用台盼蓝染色计数检测细胞活率,在49-90%范围,使用10x Genomics Single Cell 3′ v2 Reagent Kit建库,预计捕获6000个细胞,反转、扩增、纯化,最后检测浓度。作者都是按10x官方推荐的条件进行操作的。测序平台采用的是Illumina HiSeq 2500。

数据处理:细胞群聚类、分析表达差异基因、通路富集

原始bcl文件用Illumina bcl2fastq软件转换为fastq文件,并且与人基因组序列进行比对。用10x官方的CellRanger产生表达矩阵,接着用R包进行过滤、归一化、聚类。归一化后用另一个常用10x数据分析常用包Seurat进行聚类,包括PCA和t-SNE,还用Seurat做了细胞周期时相预测。基因集富集分析(GSEA)用来分析特定基因群在通路的富集。基因集变异分析(GSVA)用来分析基因簇在活跃细胞通路。在Cytoscape 中高度相关性的通路用AutoAnnotate归类并定义。作者还对检测到的基因进行了人/鼠相关性分析。

结果

经过过滤,每个样本的细胞数范围从1073到3255个; 平均一个文库检测到的UMI为5227(范围3122-6043 UMI);每个细胞检测到的平均基因数为1313(范围906-1537基因)。过滤器阈值通常设定为10%,但是肝细胞线粒体含量很高,因此作者选择了阈值为50%,以优化保留肝细胞而去除死亡和垂死的细胞。作者还过滤除去了双核细胞。

正常人肝脏细胞全景图

肝脏的主要“构建块”是肝小叶。 肝小叶包括门静脉三联体(肝动脉,门静脉和胆管),肝细胞排列在毛细血管网和中央静脉之间。在肝窦之间发现的是实质细胞(肝细胞)和非实质细胞(内皮细胞,胆管细胞,巨噬细胞,肝星状细胞和肝脏浸润淋巴细胞(包括B细胞,αβ和γδ,T细胞和NK细胞))。

定义细胞群

将所有捐赠者的细胞汇集起来,滤掉活力低的细胞后,共计捕获了8444个细胞,在无监督聚类t-SNE图中这些细胞聚集成了20个群体。用肝细胞/免疫细胞的已知基因表达谱进行热图分析。 通过将每群细胞的表达谱与已建立的肝细胞,内皮细胞,胆管细胞和免疫细胞的细胞特异性标记基因表达相匹配来指定每个细胞群的身份。

肝细胞亚群

作者发现六种不同的肝细胞群体,包括细胞群1,3,5,6,14和15,其中增殖细胞比较少。肝细胞的标志基因ALB(Albumin) , HAMP, ARG1,PCK1, AFP, BCHE 。

活跃细胞通路分析

为了研究不同细胞群的功能,作者用通路分析来鉴定每群活跃细胞通路。1区门静脉周围肝细胞在糖异生和β-氧化中具有已知的作用。 通路分析显示,Cluster 5富含肝脏门静脉功能的特征性途径,包括胆固醇和甾醇生物合成以及许多活跃的免疫途径。

两个不同的人肝巨噬细胞群

作者研究的一个重要发现是存在两个不同的人肝巨噬细胞群,似乎能够分为促炎和免疫调节两种表型,例如MARCO这一标志仅在非炎性KCs细胞中表达。使用流式细胞仪观察到了一个亚群巨噬细胞表面表达MARCO marker。免疫组化的结果表明MARCO阳性细胞的分布集中在门静脉区域。MARCO+ 巨噬细胞响应LPS / IFN-γ的刺激而分泌的TNF-α少于CD68 + MARCO- 巨噬细胞,表明CD68 + MARCO-细胞更具促炎性。MARCO在肿瘤微环境中的表达与人乳腺癌的较差结果有关。MARCO也在临床前小鼠结肠癌模型中进行了检查,观察到MARCO的表达定义了抑制性肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的亚型。 这些TAMs可以通过抗MARCO抗体极化为炎症表型,促进了肿瘤免疫原性。 这些发现为检查肝内单核细胞/巨噬细胞亚群在肝病的建立和进展中的作用提供了参考。

总结

阻碍人体肝脏研究的一个关键问题是难以获取及分离新鲜组织样本。而基于单细胞基因组学的研究肝脏组织可以在有限的样本中充分获取无偏信息,许多个体细胞群的贡献就可以被发现。以前有过小鼠肝脏图谱的研究,而现在人肝脏转录图谱则又向前发展了一大步,对研究微环境及肝功能和疾病提供了支持。

往期精彩

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