单细胞还可以人工配平一些细胞比例

我在 CNS图表复现08—肿瘤单细胞数据第一次分群通用规则 提到了，肿瘤单细胞测序通常是按照下面的4个基因表达量分布进行初步分群 ：

• immune (CD45+,PTPRC),
• epithelial/cancer (EpCAM+,EPCAM),
• stromal (CD10+,MME,fibo or CD31+,PECAM1,endo)

也仅仅是，如果不经过事先挑选，这样不同的实验条件不同的癌症病人不同的癌症进展情况拿到的这3群细胞比例肯定是不一样的。

但是我最近读文献的时候，看到2020年10月发表在cancer cell杂志的文章《Senescence Reprogramming by TIMP1 Deficiency Promotes Prostate Cancer Metastasis》，链接是：https://doi.org/10.1016/j.ccell.2020.10.012 里面提到了一个有意思的操作：

• FACS-sorted Epcam+, CD45+ and Epcam-/CD45- prostate cells were used in equal ratio as the input source for the scRNA-seq.

也就是说，我前面的 肿瘤单细胞数据第一次分群通用规则 就这样被吊打了，因为他们在还没有做单细胞的时候，就已经预分选好了，而且还配平了细胞比例。

为什么配平后比例仍然是不一致？

在 https://www.ebi.ac.uk/ena/browser/view/PRJEB40397 可以看到作者上传的单细胞转录组数据集，是10X技术的，4只小鼠，两个不同的 genetically engineered mouse models (GEMMs) 。关于单细胞的质控降维聚类分群和细胞亚群注释后的的图如下所示：

肿瘤单细胞的第一次分群

图例是：(A) t-Distributed stochastic neighbor embedding (t-SNE) plots of Ptenpc-/- and Ptenpc-/- ; Timp1-/- tumors showing epithelium, stroma and immune cells compartments.

可以看到，绝大部分都是免疫细胞，还有少量的上皮细胞，以及及其微量的基质细胞。确实好奇怪了哦，研究者在做这个单细胞的时候，明明是进行了这3种细胞的配平啊！

另外，我有一个疑问，欢迎大家留言讨论，帮我解惑！

FACS筛选不改变单细胞状态吗

很久以前我在《单细胞天地》公众号分享过一个教程：FACS挑选前后会改变细胞亚群比例组成吗，那个时候提出来的问题是：两次不同的筛选策略（CD3和CD45），拿到的单细胞转录组数据，分群后一些细胞的比例会发生变化吗？

这次我想更进一步，这个FACS筛选过程中，单细胞悬浮液肯定是饱经风霜，不可能筛选前后它的基因表达状态不被修改？

因为我发现有一些研究更夸张，比如 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE159354 这个数据集，虽然是 48个10X样品，但是实际上就10个病人（4 IPF, 3 SSc-ILD and 3 normal control lungs.），每个病人的样品分成了5份，分别是：digest and sorted via FACS into separate preparations of EPCAM+, CD31+, CD45+, and triple negative (EPCAM- CD31-, CD45-) cells.

GSM4827186 IPF F18555 Triple-
GSM4827187 IPF F18555 EPCAM+
GSM4827188 IPF F18555 CD31+
GSM4827189 IPF F18555 CD45+
GSM4827190 IPF F18555 Unsorted 

也是让人很头疼啊，该数据集对应的文章是：Osteopontin Links Myeloid Activation and Disease Progression in Systemic Sclerosis. Cell Rep Med 2020 Nov 17;1(8):100140. PMID: 33294861