单细胞时代 || 从众病之王到希望之光

作者 | 周运来

男，

一个长大了才会遇到的帅哥，

稳健，潇洒，大方，靠谱。

一段生信缘，一棵技能树。

生信技能树核心成员，单细胞天地特约撰稿人，简书创作者，单细胞数据科学家。

• From single gene analysis to single cell profiling: a new era for precision medicine
• Single-cell sequencing in cancer research
• High-dimensional immune-profiling in cancer: implications for immunotherapy
• Single-Cell RNA Sequencing in Cancer: Lessons Learned and Emerging Challenges

这不是最好的时代，也不是最坏的时代，这里是单细胞时代。灵活的单细胞系统，高效的组织解离液，开源的数据分析工具，端到端的单细胞解决方案是未来发展的趋势。这里最主要的是开放灵活的单细胞系统，有了这个系统我们就可以自主地设计反应体系，来从不同纬度捕获单个细胞的信息。

DNA和RNA的分子分析为非恶性和恶性疾病的遗传基础提供了有价值的新见解，也增加了对调节人类疾病基本机制的理解。最近的技术进步使基于基因的结构和功能变化的分析全面、高通量的方式展示，每个肿瘤类型通常对应着一个或多个关键调节细胞生长和增殖或者逃避免疫系统的通路。

单细胞技术是解析肿瘤异质性的利器，一下子把我们观察肿瘤的维度拉到了单个细胞的维度，仅就单细胞转录组就可以提供以下七个视角。

如下图，慢性髓系白血病干细胞(CML-SCs)的单细胞转录组分析。新靶向BCR-ABL的Smart-seq-2(BCR-ABL tSS2)获得单细胞突变检测和RNA测序可以研究CML-SCs的异质性，并确定耐药SCs的亚群。这种方法允许在耐药细胞中识别基因和通路的失调，这可能有助于预测疾病对治疗的反应。

长期以来，肿瘤的异质性一直困扰着癌症生物学家和遗传学家。由于基因组工具缺乏准确地测量肿瘤中的单个细胞，我们依赖于平均测量或单一标记，从而掩盖了ITH(intra-tumor heterogeneity)的许多关键方面，阻碍了我们对肿瘤生物学的理解。肿瘤中单细胞程序的精确描述使细胞生物学处于癌症生物学的中心地位。通过测量转录作为细胞类型和细胞遗传学的功能，这些努力为重新理解癌症的起始和进化奠定了基础。

传统地，通过实现信号的反卷积和突出ITH的未预期模式，癌症单细胞计划的综合分析也阐明了基于bulk 测量tumor分类。虽然对易感染性疾病的了解在一开始似乎令人生畏，但常见的细胞状态和程序正在出现，并提供了新的候选靶点，可用于治疗。这里讨论的初步研究是人类癌症单细胞基因组令人兴奋时代的开始；他们正在为更多的发现铺平道路，这些发现将来自改进的技术、分辨率、计算方法和更广泛的临床环境。

细胞类型，细胞状态，恶性和非恶性细胞

肿瘤表达多样性的分析通常显示两层：高度不同的Cluster也许被认为是“细胞”(例如,恶性肿瘤细胞、T细胞和成纤维细胞)和进一步的多样性在每个clusters可能被视为“细胞状态”如pro-gression沿着细胞周期，不同的代谢状态或其他动态程序。

细胞类型和状态基于优先表达的基因(在每个cluster或subcluster)以及其结构信息，包括大规模的拷贝数改变(CNAs)，点突变，融合蛋白。这些信息可以从scRNA-seq数据推断出，并帮助解决恶性肿瘤从良性细胞转移来的规律。最近的scRNA-seq研究的一个新主题是，恶性细胞在其表达谱中倾向于主要根据患者样本聚类，而非恶性细胞在其表达谱中倾向于细胞类型聚类，在某种程度上独立于患者的来源（个体异质性）。这表明

• 1)肿瘤间的异质性比任何特定类型的非恶性细胞都更特异。
• 2)对于恶性细胞，肿瘤间异质性远大于肿瘤内异质性。

这些结果突出了肿瘤间相当程度的异质性，并可能被误解为反映了肿瘤细胞的肿瘤内异质性的有限作用。然而，单细胞方法的强大之处在于，它们现在进一步允许我们对肿瘤内异质性的特征进行研究，这些特征很难用以前的方法来评估，而且通常是连续的，而不是离散的。

最近临床成功的免疫检查点封锁和嵌合抗原受体(CAR-T) T细胞疗法代表一个转折点。如下图，展示近20年来癌症免疫治疗的里程碑。

免疫治疗是一个快速发展的癌症治疗领域。与传统的癌症疗法相比，免疫治疗策略侧重于重新激活免疫系统，以产生抗肿瘤反应。尽管临床试验取得了令人鼓舞的结果，但仍有很大比例的患者对治疗没有反应，许多患者经历了不同程度的免疫相关不良事件。此外，现在人们越来越认识到，即使是许多传统的癌症治疗，如放疗，也可以对宿主免疫系统产生积极的影响，从而提高临床反应。因此，有必要更好地了解肿瘤免疫以便设计免疫治疗策略，特别是循证联合治疗以提高临床疗效。基于这一目标，癌症研究将注意力转向分析肿瘤微环境(TME)或外周血的免疫背景，以揭示其机制和生物标记，这可能有助于精确的免疫治疗。用于这一目的的传统技术受到数据深度和维数的限制。

然而，新技术的进步大大提高了可获得数据的广度和深度以及数量和质量。这些进展的结果是丰富的新信息和见解，关于TME如何可能被不同的免疫细胞类型影响以及这如何可能反过来影响癌症患者的临床结果。

在此，我们重点介绍目前在癌症免疫图谱中使用的一些高维技术，并总结了这些技术在设计更好的癌症免疫疗法时可能带来的见解和潜在益处。

肿瘤微环境(TME)是复杂的，包括肿瘤细胞、浸润性免疫细胞、成纤维细胞、肿瘤血管系统和细胞外基质。这些不同的细胞现在被认为在肿瘤发生、癌症进展、转移甚至对治疗的反应中起着相互作用和共同作用。肿瘤的免疫环境，即不同免疫细胞群的位置、密度和功能定位，已被证明是决定疾病预后和各种癌症治疗的疗效，特别是快速发展的癌症免疫治疗。与传统的癌症疗法不同，免疫疗法以患者的免疫系统或TME为靶点，诱导抗肿瘤免疫反应。免疫治疗策略包括细胞因子治疗、肿瘤疫苗、过继T细胞治疗和免疫检查点阻断(immune checkpoint blockades，ICB)。虽然使用免疫疗法，特别是ICBs的临床试验结果很有希望，但仍有很大一部分患者对治疗没有反应。许多患者还经历了治疗相关的自身免疫性毒性或免疫相关不良事件(irAEs)。因此，为了理解背后的响应机制和irAEs (或缺乏)免疫治疗，人们试图对TME或外周血的免疫环境进行分析，目的是发现可能对一个增强临床指导治疗的新策略和生物标记物。

用于免疫分析的各种技术可分为两大类：

• 基于转录组的技术
• 基于蛋白质组的技术。

传统技术有许多限制，如较少的可用分析参数，需要大量的样本和相互重叠的检测，逐渐被新的高维技术改善。这些当前的前沿技术为研究人员提供了前所未有的能力，可以深入研究TME或癌症患者外周血免疫表型。这篇综述强调了最新的高维技术用于癌症的免疫分析，并研究了它们可能带来的见解和潜在的好处，特别是对推进癌症免疫治疗的进展。

癌症中的常规免疫分析工具

早期的免疫分析技术为肿瘤与免疫细胞相互作用背后的机制提供了有价值的见解，并促进了在疾病预后的生物标志物发现和治疗反应预测方面的突破。这些技术包括bulk 转录组分析，如基因芯片和bulk RNA测序，以及低维蛋白基础平台，如早期基于荧光的流式细胞术和传统的免疫组织化学(IHC)。

尽管如此，这些技术有其固有的局限性，这限制了对肿瘤免疫景观的深入理解。例如，传统的bulk 转录分析，如微阵列和RNA序列分析，依赖于从肿瘤组织中集合的细胞群中提取RNA。因此，这种bulk 转录组方法妨碍了稀有细胞类型的识别，也妨碍了具有相似表达模式的细胞之间或肿瘤细胞与免疫细胞之间的分辨。它也限制了对单个细胞类型的功能和/或表型的理解。

对于基于蛋白质的分析，技术的进步和新荧光色素和激光探测器的发展使最先进的流式细胞仪能够同时常规测量多达18种不同的蛋白质标记物。然而，传统的基于荧光的流式细胞术受到荧光色素发射光谱重叠的限制，使用更多的荧光色素加重了这个问题。这使得在这个平台上对细胞表型进行详细的检查变得困难，因为在生物系统如肿瘤中需要更多的参数来区分复杂的免疫亚群。

传统的免疫组化或免疫荧光显微镜可以使用酶标记或荧光标记抗体检测组织切片内的细胞抗原，并有助于识别细胞类型及其在组织内的空间位置。然而，由于显色或荧光光谱重叠，不能同时使用超过4个标记。因此，传统的免疫组化技术在捕获肿瘤浸润免疫细胞中存在的免疫表型的异质性和复杂性程度方面也存在不足。

因此，尽管上述传统技术提供了肿瘤免疫全景的良好图景，但它们可能无法有效捕获TME内动态系统中免疫表型的复杂性和深度以及潜在功能线索。

下一代癌症免疫图谱的高维技术

为了满足捕获细胞异质性和检测罕见免疫亚群的需要，技术已经向单细胞能力和高维分析的新技术发展，如单细胞RNA-Seq (scRNA-Seq)、（cytometry by time of flight）细胞计数(CyTOF)和多重免疫组化(mIHC)。这些技术克服了传统免疫图谱技术的诸多局限性，在生物标志物的发现和免疫机制的理解上取得了突破性进展，特别是在肿瘤免疫学领域。

scRNA-Seq的发展解决了bulk 转录数据的局限性，使其在单细胞间的表型和功能异质性分析中更加有用。它建立在RNA- seq的概念上，加上分离单个细胞的额外步骤，接着是一个多重扩增过程，从微小的细胞RNA数量生成cDNA。这使得在单细胞水平上分析转录组成为可能，同时保持了大量分析方法的准确性和复杂性。最近的进展加上组织成像能力提供了这些scRNA-seq数据的额外和有价值的空间信息。

除了scRNA-seq之外，转座酶可达染色质测序的单细胞分析(scac -seq)也可用于研究表观遗传改变。scATAC-Seq识别活跃的DNA调节元件，并允许在单个细胞水平快速和敏感的谱分析全基因组染色质可达性。

另一方面，CyTOF通过结合质谱和流式细胞术，使用与稳定的稀土金属同位素(镧系金属)结合的抗体而不是荧光团，解决了传统荧光流式细胞术有限的维数问题。样品被雾化到单细胞液滴中，由高温等离子体汽化产生一个带有重金属探针离子的离子云，然后使用质量-电荷比对其进行量化。由于这些金属报告器在生物标本中不常见，所以产生的背景信号很小。最后，同位素的离散读出很少或没有重叠光谱。在单个细胞上可以检测到40多个标记，而不需要结合更小的、单独的抗体面板（panel），从而大大提高了细胞分析的维度。

染料循环技术的进步，染色、成像和染料灭活是重复进行的，使得使用荧光显微镜在同一组织样本上检测到多达61种不同的抗原。与此同时，结合质谱的mIHC新技术已经被开发出来，可以使用结合CyTOF的激光消融组织同时成像32个蛋白，使用多路离子束成像(MIBI)同时成像35个和多达100个蛋白。基于大规模细胞瘤的mIHC技术是仍在发展中的有前途的技术。此外，在荧光成像硬件和软件以及荧光染料方面的进展使得在单个切片上可以同时对多达7个荧光标记进行常规成像。这一突破克服了传统免疫组化或免疫荧光共聚焦系统只能使用2 - 4个标记物的限制。

这些新技术产生的数据使研究人员能够在单细胞水平上进行深度的免疫表型研究。更重要的是，这些先进的多维技术的组合正在越来越多地用于复杂免疫反应的研究，产生了使用老一代技术难以获得的见解。下面几节将介绍这些研究的一些重点。

多维免疫谱分析揭示了TME免疫亚群表型和功能的复杂性

随着能够在单细胞水平上对免疫细胞进行深度分析，研究人员现在已经开始更好地认识到免疫反应的复杂性、免疫亚群之间的相互作用以及TME中宿主和基质细胞之间的相互作用。如表1（略，可在原文献中查看）所示，这些研究强调了单细胞高维分析捕捉TME细胞间可能存在的复杂网络和关系的能力。他们也使免疫细胞类型的识别和帮助我们了解他们的存在可能会影响当地的抗肿瘤免疫反应(图2)。这样的复杂性和异构性在传统bulk分析框架下是不可能感知的。

例如，在一项关于透明细胞肾细胞癌(CCRCC)的研究中，CyTOF被用来询问T细胞和肿瘤相关巨噬细胞(TAM)人群。T细胞上的耗竭标记，如TIM3和CTLA4的表达被发现是异质的，其中PD-1广泛表达。提示抗pd -1免疫治疗对CCRCC可能有效。此外，CD38+CD204+CD206- TAMs与免疫抑制T细胞表型相关，表现为与PD-1+CD8+ T细胞和调节性T细胞(Tregs)呈正相关。这一发现通过mIHC (4-color)的观察得到验证，在mIHC中这些TAMs可以与肿瘤中的CD8+ T细胞共定位。在表征T细胞和TAM群体时，本研究提供了一个CCRCC的免疫图谱，这将有助于理解免疫治疗背后的机制。

同样，Chew等人的一项研究使用CyTOF对肝细胞癌(HCC)的TME、邻近的非TME和外周血单核细胞(PBMCs)进行了深度免疫分析。研究发现，关键的免疫亚群，如T细胞、自然杀伤细胞(NK)和髓细胞在这三个隔室中富集不同。使用耗尽标记(PD-1、lag3)、免疫抑制标记(IL-10)和炎症反应标记(TNFa、IFNy、GzB)研究每个亚群的功能表型。研究发现，与有肝炎感染慢性炎症背景的邻近非肿瘤肝组织相比，TME内的免疫细胞更加疲劳和免疫抑制。

mIHC也被用于验证在福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织上的CyTOF发现，显示treg和耗尽的CD8+ T细胞确实在TME中富集。此外，pd -1表达的记忆性CD8+ T细胞丰度在晚期肿瘤中降低，表明它们在肿瘤进展中发挥作用。本研究深入了解了浸润性免疫细胞在暴露于不同微环境时的不同表型和功能，认为TME中免疫细胞处于更加衰竭的状态，为ICB疗法在HCC中的成功应用提供了理论依据。

单细胞转录组技术的发展也使研究人员能够更全面地捕获TME内免疫亚群的异质性，并追踪它们的发育关系。在Zheng等对6例HCC患者的研究中，我们对从TME、非TME和外周血中分离出的5063个个体CD4+和CD8+ T细胞进行了scRNA-Seq，以解剖其转录组谱和T细胞受体(T cell receptor, TCR)序列。在HCC TME中发现了CD8+FoxP3+调节样细胞等独特的亚群，并通过mIHC进行了验证。我们还发现，与非TME或PBMC相比，TME内CD8+ T细胞和treg细胞的克隆性扩张更大。最后，在单细胞水平上定义TCR序列的能力使得研究这些T细胞簇的发育关系和激活状态成为可能。推测衰竭T细胞群与中间发育群体而不是完全分化的效应群体关系更密切，使这些中间群体成为有吸引力的检查点治疗靶点。这些详细描述HCC免疫系统发展和组成的大量数据对于理解和发展新的治疗策略将是一个有价值的资源。

Azizi等人对乳腺癌进行了类似的scRNA seq研究，但从8名患者收集了47016个免疫细胞。作者发现，与正常乳腺组织相比，肿瘤组织中T细胞和髓细胞的异质性显著增加，其独特细胞亚群的数量约为正常乳腺组织的两倍。对这种多样性贡献最大的基因与诸如炎症、缺氧和营养供应等信号通路有关，这表明在适应不利的TME时存在复杂的反应和改变。成对的scRNA-Seq和TCR测序也使作者能够绘制每个细胞中TCR克隆的基因表达，他们的数据表明，T细胞的表型状态可能受到TCR刺激和TME信号的影响。此外，在巨噬细胞中，M1和M2相关基因经常在相同的细胞中表达，挑战了传统的巨噬细胞极化表型模型。提取这些详细信息的能力将有助于提高对免疫细胞在乳腺癌中的预防或抗肿瘤作用的理解。

Zhang等对结直肠癌(CRC)的另一项研究也使用了scRNA-Seq和TCR测序，绘制了从肿瘤组织、邻近正常组织和外周血中分选的T细胞的分布、克隆扩增、迁移和发育转变。与之前的研究相似，他们发现肿瘤组织由CD8+和CD4+ T细胞组成，其表型更加衰竭、向外扩张和较少的可移动性，而正常组织和外周血则与较初始或近期激活的表型相关。作者还能够根据TCR克隆类型分析这些跨组织类型的免疫亚群之间的发育模式，并确定与t效应记忆细胞发育相关的CX3CL13+BHLHE40+IFNG+ th1样细胞的群体。这些细胞在CRC肿瘤中富集，表现出微卫星不稳定性，这是一种与抗pd1免疫治疗反应相关的肿瘤表型。因此，单细胞技术使作者能够更好地解释成功免疫治疗背后的机制，并为将这些新T细胞作为治疗靶点提供了基础。

对开放的、活跃转录的染色质区域的研究也可以为TME的免疫细胞异质性带来新的见解。Satpathy等人使用scat - seq检测接受抗pd1免疫治疗的基底细胞癌患者原发性肿瘤活检的染色质谱。我们发现CD8+耗尽T细胞和T滤泡辅助细胞在治疗后均有扩张。此外，这两种细胞类型共享一组与分化相关的转录因子基序，表明在抗pd1免疫治疗后，共同的基因调控程序推动了它们的发展。

Angelo等人描述的mIHC技术称为MIBI，在未来肿瘤组织的多重TME研究中具有巨大的潜力。36这种方法使用氧初级离子束来光栅化组织样品表面，在相同视场的重复扫描周期中，技术上能够检测到多达100种不同的标记物。该技术于2014年首次被描述，现在已被改进为全自动，并用于询问三阴性乳腺癌(TNBC)的TME。通过36种靶向肿瘤相关蛋白、功能标志物、免疫相关和免疫调节蛋白的标志物，作者能够构建TNBC的肿瘤免疫景观，并将组织结构和细胞表型等特征与患者的临床参数相关联。例如，他们将TNBC中的肿瘤免疫组成和组织分为三种类型:冷(免疫细胞少)、混合(肿瘤和免疫细胞混合在一起)和区隔(肿瘤和免疫细胞空间分离)，并发现区隔的组织与更好的生存相关。

Lavin等结合多维技术对早期肺腺癌的免疫微环境进行了解剖。CyTOF和scRNA-Seq分析发现，与正常肺细胞相比，肿瘤巨噬细胞有明显的特征，肿瘤特异性巨噬细胞与肺内巨噬细胞基因表达的高比值与较差的患者生存率相关。与正常肺组织相比，肿瘤中淋巴细胞和抗原呈递细胞(APCs)的表型也有明显变化。如NK细胞、CD16+单核细胞、CD141+树突状细胞(DCs)减少，而肿瘤组织中PPAR型hi巨噬细胞富集。CD141+ dc在T细胞募集和三级淋巴样结构的形成中尤为重要。此外，肿瘤病变的这种免疫特征与TNM分期无关，这表明针对这种固有免疫通路的免疫治疗，特别是肿瘤浸润骨髓亚群，可能在早期就对患者有益。因此，结合使用scRNA-Seq、CyTOF和mIHC使作者能够理解和解释免疫细胞的相互作用如何有助于肿瘤的发生，并利用这些信息为患者制定潜在的新的治疗策略。

免疫治疗生物标志物的高维免疫分析

这些先进的高维技术除了能加深对TME中局部免疫应答的理解外，在筛选免疫相关基因和/或蛋白标记方面也具有很高的价值，这些基因和/或蛋白标记可能作为预测癌症治疗反应的潜在生物标记(表2，略)。

一项针对HCC的特殊研究研究了对y90放射栓塞(Y90-RE)的免疫应答，使用CyTOF对肿瘤浸润的白细胞和PBMCs。45作者跟踪了Y90-RE治疗前和Y90-RE治疗后的免疫应答，检测到治疗后pbmc中免疫亚群的增加，如TNF - TNF -表达CD8+和CD4+ T细胞和APCs，表明Y90-RE治疗引起了积极的系统性免疫应答。他们还发现，在治疗前和治疗后的pbmc中，对Y90-RE治疗表现出持续治疗反应的患者显示CD8+ T细胞表达PD-1(提示预处理)和趋化因子受体CCR5和CXCR6(提示归向肿瘤)的百分比较高。基于免疫标记在PBMCs预处理中的差异表达，建立并验证了Y90-RE治疗持续临床反应的预测模型。因此，进行深度免疫表型的能力可以指导临床反应的潜在预测性生物标志物的发现，以帮助患者作出治疗决定。基于免疫标记在PBMCs预处理中的差异表达，建立并验证了Y90-RE治疗持续临床反应的预测模型。

类似的预测免疫治疗反应的研究也在黑色素瘤中进行。Krieg等也使用CyTOF对抗pd1免疫治疗前后黑色素瘤患者的淋巴细胞和髓细胞进行了表征，发现CD4+和CD8+ T细胞的频率较低，而髓细胞的频率较高。这也反映在TME中，反应者有更高频率的肿瘤浸润CD4+和CD8+ T细胞。此外，在抗pd -1治疗前，患者外周血单核细胞中发现了更高频率的具有抗原表达能力的CD14+CD16-CD33+HLA-DRhi单核细胞，因此预测其对治疗和生存的反应更佳。46这些单核细胞也表达ICAM-1，提示处于更活跃的状态。因此，本研究为在抗pd1治疗前对患者进行临床分层验证免疫细胞特征提供了理论基础。

除了CyTOF, scRNA-Seq也被证明在寻找潜在的预测治疗反应的生物标志物方面非常有用。Sade-Feldman等人对基线和治疗期间接受免疫检查点治疗的转移性黑色素瘤患者的肿瘤活检进行了单细胞分析。他们发现，根据基因表达，活组织检查中的CD8+ T细胞可以聚集成两种主要状态:一种状态与记忆、激活和存活(包括Wnt转录因子-7、TCF7)有关，另一种状态与细胞衰竭有关。肿瘤中活化和衰竭的CD8+ T细胞的比例与患者对免疫治疗的反应有关。随后通过免疫组化染色验证了这一点，即在基线和治疗后，肿瘤组织中较高的记忆密度和激活的TCF7+CD8+ T细胞确实与更好的免疫治疗反应相关。因此，本研究强调了scRNA-Seq在筛选可能受益于免疫治疗的患者的肿瘤浸润免疫细胞中潜在的生物标记物的能力。

生物标志物的发现并不局限于免疫细胞类型;在恶性细胞中也可能发现潜在的生物标记。Jerby-Arnon等利用scRNA-Seq报道了一种由黑色素瘤肿瘤细胞表达的免疫抵抗分子标记，该标记与CD8+ T细胞浸润水平降低和对免疫检查点治疗的抵抗有关。作者通过mIHC验证了这一点，结果显示，该耐药程序(p53、Myc、DLL3、HLA-A、c-Jun、SQSTM1和LAMP2)的表达模式与肿瘤组织中的T细胞排斥有关。此外，研究表明，这种耐药程序可能被CDK4/6抑制剂调控。因此，scRNA-Seq提供了鉴定恶性细胞上可能预测免疫治疗反应的生物标记物的能力，并合理地制定可能的药物靶点来增强这种反应。

高维免疫监测也可用于识别免疫治疗诱发的irAEs的潜在预测性生物标记物。例如，采用流式细胞仪、CyTOF和scRNA-Seq联合分析联合ICB或单ICB(抗ctla -4或抗pd -1)治疗的晚期黑色素瘤患者循环B细胞的变化(预处理和治疗后)。研究发现，免疫治疗后整体B细胞数量显著下降与联合ICB后发病时间更短、irAEs级别更高有关，这可能为免疫治疗诱导的自身免疫提供了早期生物标志物。此外，本研究发现，免疫治疗后循环CD21lo B细胞激活增强和IFN-阻断信号通路增加，提示该群体可能是ICB的非预期靶点。因此，这些高维技术显示了识别生物标记物以预测免疫治疗诱导的irAEs的潜力，从而在临床中提供更好的治疗策略。

需要承认的是，在许多这样的研究中，特别是那些采用scRNA-Seq的研究中，纳入的患者队列很小，这就提出了样本偏倚小的问题。尽管如此，它们显示了这些高维技术在筛选潜在生物标志物预测免疫治疗后临床结果方面的能力，并为在更大的患者群体中验证这些特征提供了合理的基础。

多维免疫分析技术的未来发展方向

单细胞、多参数技术的发展已经彻底改变了免疫图谱的领域。尽管如此，在通量、可伸缩性和成本方面仍有很大的改进空间。新的分析技术和方法正在开发中，这将使研究人员能够在更高的维度和深度上进行分析。

镧标记抗体的使用和质谱检测已经在组织成像中被探索，利用CyTOF的高维能力进行空间解析的蛋白质组测量。35除MIBI(如上所述)外，另一种激光消融FFPE组织并结合CyTOF mass cytometer可实现32-plex IHC蛋白及其修饰分析。这项技术后来被扩展到包括mRNA分析，使得在乳腺癌组织单细胞水平同时检测3种mRNA和16种蛋白。在这项研究中，作者能够研究HER2和CK19基因的mRNA和蛋白水平之间的单细胞相关性。他们还发现，表达CXCL10(一种T细胞趋化剂)的细胞经常聚集在一起，并与样本中较高频率的T细胞相关。随着多路复用能力的提高，这项技术在进一步研究TME中mRNA、蛋白质和信号网络之间的关系方面具有巨大的潜力。与传统的免疫组化相比，这些基于mass - cytomgraphy的组织蛋白组成像技术拥有一些优势。一是背景或样品的自发荧光信号减弱，镧系金属报告器之间的光谱重叠很少或没有。此外，mIHC还能提供TME内免疫细胞的空间或定位信息。最后，mIHC技术能够最大限度地获取大量信息，使我们能够充分利用具有长期患者随访历史的丰富常规存档的FFPE临床样本。

RNA测序目前也正在探索作为进行空间研究的工具。在一种称为空间转录组学(ST)的方法中，31个寡核苷酸被固定在带有点阵列的玻璃载玻片上，每个点阵列包含一个位置条形码。低温保存的组织切片被安装在这些载玻片上并进行成像，接着是组织mRNA的通透性和反转录。在探针从载玻片中释放出来并测序之后，位置条形码允许基因表达与其在组织中的原始位置匹配。这使得基因的空间表达，尽管是体积，可以从组织切片的特定位置来确定。这种技术的主要限制是缺乏单细胞分辨率，因为每个这些点捕获了来自同一区域的至少10个或更多细胞的转录组。作为该方法的扩展，我们将scna -seq与ST整合，分别从同一组织的一半进行scRNA seq和ST检测，并通过比较scRNA seq定义的基因签名与在同一区域富集的ST基因来推断特定细胞亚群的富集情况。使用统计反卷积方法可以推断出特定的细胞类型，该方法以前曾用于估计大块组织RNA序列数据中的细胞类型比例。这种方法可以鉴定胰腺导管腺癌的三种癌细胞群及其在肿瘤中的不同位置。

此后，利用多路荧光原位杂交(MERFISH)技术进一步扩展了RNA的成像，该技术能够在单细胞水平上成像多达10,000种RNA。3054个细胞RNA用编码探针标记，编码探针包含一个目标序列和两个读出序列，然后用读出探针进行连续轮杂交和成像。因此，RNA在单分子水平上的表达可以定位在单个细胞的空间上。此外，利用La Manno等人改进的RNA速度方法，构建了细胞周期相的伪时间序列。最后，将scRNA-seq联合MERFISH对小鼠下丘脑视前区进行研究。有了这些先进的工具，可以想象TME内肿瘤和免疫细胞的特征、表型和定位可以更清楚地定义，从而更好地理解肿瘤进展机制和对治疗的反应。

越来越多的测序技术被用来提高免疫蛋白质组分析的多路复用能力。例如，最近开发的抗体测序技术(Abseq)已经增加了单细胞蛋白图谱的维度，甚至更大的程度，提供了理论上无限制的多路复用能力。Abseq使用DNA低核苷酸标记抗体，这些抗体通过液滴微流体条形码和DNA测序技术在单细胞水平上被识别。Abseq具有10个碱基的短标签长度，提供了超过100万个独特的表位识别序列，并可以在理论上标记人类蛋白质组的每一个成员，检测低表达如同每个细胞的单个抗体。作为Abseq的扩展，另一种技术被称为通过测序的转录组和表位的细胞索引(CITE-Seq)，可以同时进行单个细胞的蛋白质组和转录组的无偏性、多路分析。通过寡核苷酸偶联抗体(类似于Abseq)检测到58个蛋白表位。在分裂成单细胞滴后，细胞裂解释放细胞mRNA和结合到细胞表面表位的寡核苷酸，以便进行单独的分析。这项技术提供了同时研究单个细胞内基因和蛋白表达的能力，将使研究人员了解细胞如何在不同的生物条件下调节其转录组和蛋白表型。这些技术目前只适用于表面蛋白标记物的检测，这一局限性可以通过RNA-seq技术的未来改进而克服。

在一个scRNA-Seq实验中产生的大量数据也提供了丰富的信息，这些信息可以用不同的方式进行分析，允许研究人员从不同的角度进行调查。其中一个维度被称为拟时序分析，指的是根据细胞表达模式的相似性对其沿轨迹进行排序的计算模型。这些模型也被称为轨迹推断(TI)方法，其运行假设是，单细胞数据是不同细胞在不同时间点沿着一个共同发育过程的连续过程的快照。60多种TI方法可用，Salens等人(2019)对此进行了综述。这种分析可能有助于理解免疫细胞的发育是如何受到肿瘤进展的影响，反之亦然。例如，上面提到的Zheng等人的研究也对TME中的CD8+ T细胞进行了拟时间分析，将CD8细胞簇按照从初始、到效应、最后到衰竭表型的顺序排列，证明了从激活到衰竭的过渡。

许多单细胞技术目前还处于起步阶段：规程和技术仍在优化中。因此，在临床环境中对患者进行大规模筛查的成本可能过高而不可行。尽管如此，随着这些技术的改进和商业化，提高效率和通量以及降低成本将使它们在未来可用于临床实验室。

免疫治疗的意义和结论

TME在分子和免疫学特征上具有异质性和复杂性。TME中的多种免疫亚群和因素对免疫治疗的结果和疾病预后有很大影响。如上所述，特异性免疫细胞类型的招募或积累极大地影响了免疫逃避与抗肿瘤活性之间的平衡，以及患者对治疗的反应，进而影响TME的免疫应答。

重要的是，这些细胞亚群的变异，无论是在癌症类型内部还是在癌症类型之间，阻碍了对所有患者开发一种单一有效的治疗方法。因此，癌症免疫疗法的成功可能取决于能否根据患者的免疫状况，为每个患者量身定制个性化的治疗疗程。为了实现这种个性化治疗，有必要能够捕获每种癌症类型中TME的异质性，并对每种网络如何交互和功能有一个系统的理解。这些知识将有助于预测临床对治疗的反应，以及为患者设计更好的治疗策略。在单细胞水平上进行深度免疫表型，并同时提取转录组、蛋白质组和空间信息的能力，使我们更接近设计更有效的个性化免疫治疗的目标。

注：<单细胞时代 · 2021春节系列> 是参考学术或媒体文章整理而来，个人水平有限，错讹难免，还请读者诸君批评指正。内容均为个人观点，不代表任何单位，也不构成就业或投资建议，图片来自网络，侵删。

References

[1] https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-020-01549-3 [2] https://jeccr.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13046-018-0937-6