m6A联合单细胞解密RNA甲基化修饰如何影响皮肤形态发生过程

前面我提到了有学员提问： 新的ngs流程该如何学习之m6A学习大纲，所以我给了他优秀学员想要MeRIP-Seq/m6A-seq教程，但是他似乎是并没有主动给我投稿，不过我们的转录组授课讲师也感兴趣了这个技术，想丰富一下课程内容，所以开启了这个系列学习哈！

下面是转录组讲师的投稿

文章信息

文献标题：m6A RNA methylation impacts fate choices during skin morphogenesis

发表杂志：eLife(IF7.551)

发表时间：26 August 2020

原文doi：10.7554/eLife.56980

关于作者-Samie R Jaffrey

他是m6A研究领域的大佬之一，关于他最有名的可能是2015年发表的那篇第一次在单碱基水平鉴定了m6A修饰的方法文章[Nat Methods. 2015 Aug;12(8):767-72]。

个人介绍主页：https://research.cornell.edu/researchers/samie-jaffrey

文章摘要

N6-甲基腺苷是哺乳动物中最主要的RNA修饰。本研究中，作者通过研究小鼠皮肤胚胎发生这一过程来追踪m6A的功能和生理重要性。

首先，作者考察了皮肤上皮祖细胞中mRNA的m6A修饰概况。结合核糖体测序分析，发现编码序列中的m6A修饰与翻译增强之间具有相关性，特别是关键形态发生信号通路的翻译增强。通过研究生理相关性，发现m6A缺失会显著改变这些线索，扰乱皮肤谱系中的细胞命运选择和组织结构。通过单细胞测序，发现m6A缺失后信号通路和典型翻译通路均显著下调。然而，有趣的是，许多高m6A修饰的mRNA在m6A缺失时显著上调，它们编码RNA甲基化、RNA处理和RNA代谢因子。总之，我们的研究结果表明，m6A修饰可以增强关键形态发生调节子的翻译，同时还使前哨mRNA不稳定，当m6A水平下降时，这些前哨mRNA被激活以激活救援途径。

实验设计

m6A miCLIP测序：

测序：50bp paired

预处理：Grozhik et al., 2017

m6A位点识别：CIMS analysis was analyzed with seqLogo/R package

Normalized-to-input uTPM over identified m6A sites：GenomicRanges Bioconductor/R package

m6A sites 注释：ChIPseeker package

外显子，CDS，UTR区域注释：GTF，GenomicFeatures Bioconductor/R package

每个转录本的SN-uTPM ：the sum of signal for all normalized-to-input uTPMs within the exons of a specific transcript

m6A site可视化：Olarerin-George and Jaffrey, 2017

m6A水平的GSEA：fgsea Bioconductor package ，mSigDB中的C2和C5

单细胞测序：

使用FACS分离control and cKO samples中YFP+ epidermal cells (上皮细胞)

Chromium Single Cell 3’ 建立文库，NextSeq 500测序。

使用Cellranger (version 2.1.1) 得到COUNT，Seurat2.3.4 进行数据整合和分析。

细胞过滤：去掉了表达<1800 genes的cell和<10 cells的gene。

细胞注释：使用已知markers。

时序轨迹分析：monocle (version 2.10.1)

差异表达分析和GSEA分析：MAST (version1.8.2, Finak et al., 2015)

miCLIP and ribosome profiling之间的相关性分析：使用核糖体RNA测序评估翻译效率。

主要结果

1.m6A高度修饰的转录本参与毛囊形态发生

首先，作者使用单碱基水平的miCLIP测序评估了生理条件下小鼠表皮细胞中mRNA的m6A修饰的位置和程度。

miCLIP测序结果概况：

• 3例基底皮肤祖细胞进行miCLIP测序，总共得到11420个转录组，157641个m6A位点，典型的'DRACH' motif。(图D)
• m6A修饰主要集中在mRNA转录本的终止密码子部分。(图E)

• 结合核糖体RNA测序数据，看m6A修饰与翻译效率之间的关系：作者发现，m6A修饰水平高的mRNA比m6A修饰水平低的mRNA更容易被翻译(图1F)。这种现象在编码序列中的最为显著。

• 对具有m6A修饰的mRNA进行GSEA分析：有basal cell carcinoma相关的WNT，SHH信号通路。有NOTCH信号通路。排在前三的通路相关基因翻译效率更高。而这些通路在HF的形态发生中起重要作用(图H)。

基于以上几点，m6A测序结果表明：有大量的mRNA具有m6A修饰，但是m6A修饰的这部分mRNA的GSEA分析结果显示并没有某一个功能类的富集打分超高。然而，WNT和SHH途径在多个最高富集类别中出现的这一事实表明m6A可能在促进毛囊命运中起作用。

2.表皮祖细胞中Mettl3基因低或不表达导致毛囊形态发生出现明显缺陷

先来看看Mettl3基因是何方神圣：RNA甲基化修饰过程主要与三类蛋白相关（图A）：

• writers：甲基化转移酶，主要有METTL3、METTL14和WTAP
• Erasers：去甲基化酶，FTO和ALKBH5
• Readers：甲基化修饰位点识别酶，YTHDC1以及定位在细胞质中的YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC2

在哺乳动物mRNA中，m6A修饰存在于7000多个基因中，保守基序为RRACH (R = G, A; H = A, C, U)。m6A修饰富集在mRNA终止密码子附近。大多数细胞的RNA 的m6A修饰主要靠METTL3-METTL14复合物进行添加，而Mettl3 or Mettl14的不表达会使细胞内的m6A修饰大量减少。

因此，为了研究m6A缺乏对皮肤形态发生的影响，作者设置Mettl3基因敲除小鼠实验：Mettl3 conditional knockout (cKO) mice。

在整个胚胎发生过程中，对照组和cKO小鼠在外观上大致相当(图D)。

然而，从出生后第2天(P2)开始，Mettl3基因敲除小鼠的表型就开始出现异常。**最明显的是，与对照组相比，它们的体型和体重都在逐渐下降，并且大多数都活不过6天。**为了调查致死性原因，首先排除了脱水导致的死亡，然后口腔组织检查发现牙齿和舌头都已经形成，但是此时为哺乳和食物摄入所必需应该出现的舌状丝状乳头并没有形成。cKO小鼠的背部皮肤毛囊形态也发生了明显变化。

基于这些数据，Mettl2基因缺陷似乎并未反映出发育延迟，而是改变了形态。在这方面，舌丝状乳头和皮肤HF缺陷这一结果尤其有趣，因为它们的形态发生均需要WNT和SHH信号传导。

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至此，作者似乎找到了m6A修饰与皮肤毛囊发生之间的关联性：WNT和SHH信号传导。

3.接下来，作者通过单细胞测序分析了m6A缺失引起的转录组层面的变化：m6A的丢失导致了毛囊谱系单细胞转录组内的扰动

我们通过单细胞RNA测序确定m6A的缺失对全局基因表达的后果。

单细胞测序：4443 control cells and 3455 Mettl3 null cells。基于已经发表的markers，tSNE分析产生7个主要的clusters。

• 三个基底表皮祖细胞(Epi basal)相关类：高表达Krt5 和 Krt14
• 一个分化的基上表皮角化细胞(Epi suprabasal)：高表达Krt1 和 Krt10
• 三个HFs相关类
  • WNThi：高表达Shh, Lef1 和 Ctnnb1
  • WNTlo：Krt17 and Sox9高表达，Lef1低或者不表达

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7个cluster的markers的热图展示。

为了评估谱系分化轨迹，我们对对照和cKO转录组均进行了时序分析，时序分析结果：

对于对照皮肤组，大多数细胞沿着两个主要分支：

• 毛发分支( a hair germ branch)，主要由WNT^hi^（Krt17 ^+^ Lhx2 ^+^ Sox9^neg^）和WNT^lo^（Krt17 ^+^ Sox9 ^+^ Tgfbr2 ^+^）细胞组成
• 小孔间表皮分支( an interfollicular epidermal branch)，Krt5^hi^Krt14^hi^的基底祖细胞和他们的基底上Krt1 ^+^ Krt10 ^+^后代

而在cKO中，与表型异常相一致，沿HF分支( hair follicles branch)的WNT^hi^细胞的数量显着减少。

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4.其他结果

我们还观察到了METTL3缺失会引起信号通路和经典翻译起始因子下调，METTL3缺失后出现了相应的补偿机制，METTL3缺失后上调的那部分RNA代谢增强，即表现出高m6A修饰的mRNA通常在METTL3丢失后上调而不是下调。

总结

尽管对m6A修饰在mRNA降解和翻译中所起作用的分子机制的了解越来越多，但仍然不清楚这种丰富的修饰如何影响组织生物学。这篇文章的研究发现了一些有关m6A行为的新见解，并在结合和增进我们对先前体内和体外研究中出现的某些重复出现主题的认识方面取得了进展。重要的是，这篇文章使m6A修饰成为干细胞命运选择和翻译控制的关键整合者。

可以说是结合了目前的热点单细胞技术手段进行m6A相关功能研究的一篇文章吧。使用的是热点基因（甲基化转移酶METTL3）敲除+单细胞，并不是单细胞甲基化研究，目前好像还没有看到单细胞在表观层面上的相关技术研究，也可能是我看的文献太少了吧。