4+分干细胞相关的非编码RNA新套路

大家好，今天和大家分享的是2020年2月发表在Aging（IF=4.831)上的一篇文章：Cancer stem cell-specific expression profiles reveal emerging bladder cancer biomarkers and identify circRNA_103809 as an important regulator in bladder cancer，“癌症干细胞特异性表达谱揭示了新兴的膀胱癌生物标志物，并确定circRNA_103809为膀胱癌的重要调节物”。在这篇文章中，作者基于来自三个膀胱癌标本的两个微阵列的RNA表达数据，分析了与膀胱癌非干细胞（BCNSC）相比在膀胱癌干细胞（BCSC）中差异表达的circRNA，lncRNA和mRNA，并进一步探究了circRNA_103809的功能。同时，作者也对筛选出来的差异表达circRNA、lncRNA等进行了通路分析和加权基因共表达网络分析（WGCNA）。

Cancer stem cell-specific expression profiles reveal emerging bladder cancer biomarkers and identify circRNA_103809 as an important regulator in bladder cancer

癌症干细胞特异性表达谱揭示了新兴的膀胱癌生物标志物，并确定circRNA_103809为膀胱癌的重要调节物

一、研究背景

膀胱癌（BC）是全球最具威胁的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率很高。最近的研究表明肿瘤干细胞有调节分化、自我更新、耐药的作用，这意味着它们在癌症的发生和发展的过程中可能有重要的地位，然而，膀胱癌干细胞（BCSCs）的潜在分子机制，尤其是表观遗传学特征，仍然有待探索。

lncRNA（长链非编码RNA）与circRNA（环状RNA）同样在癌症的发展中发挥较大的作用，例如，差异表达的lncRNA可以通过顺式或反式调节其靶基因的表达发挥其功能，从而促进乳腺癌，肺癌和结肠直肠癌的侵袭和转移；而circRNA可以作为miRNA的sponge发挥作用，因此也可以抑制其功能。

二、分析流程

三、结果解读

1、BCSC中mRNA，lncRNA和circRNA的差异表达情况

之前的研究表明，单克隆抗体BCMab1与CD44结合使用时可用于分离人膀胱癌干细胞，为了鉴定与BCSCs功能相关的基因，作者对从三名BC患者中分离出的BCSCs（BCMab1 + CD44 +）和BCNSCs（BCMab1-CD44-）进行了转录组微阵列分析。在经过数据预处理后，作者构建了3对BCSCs和BCNSCs样本的表达矩阵。图1为获取差异表达情况的方法。火山图则用于展示BCSC和BCNSC之间的mRNA、lncRNA和circRNA的表达差异（见图2，p＜0.05，log2FC＞1）其中红点表示差异表达的RNA。

图1：获取表达情况的流程

图2：mRNA、lncRNA、circRNA的差异表达火山图

层次聚类分析展示了这些RNA在不同样本中的表达（图3），从图3聚类分析的结果中可以看出这些RNA在样本的表达存在系统性差异，表明BCSC中的mRNA，lncRNA和circRNA的表达与BCNSC中的表达不同。

图3：层次聚类分析的结果

2、膀胱癌非编码RNA的结构特征和染色体分布

在鉴定出差异表达的lncRNA和circRNA后，作者自然想到了研究这两种RNA共同的结构特征以及在染色体的分布情况，从而为下一步的研究埋下伏笔。为了探究这两种非编码基因在膀胱癌细胞中的结构特征，作者对在该微阵列中检测到的lncRNA和circRNA的基因结构和序列保守性进行了分析。结果表明，基因间和天然反义lncRNA在所有表达的lncRNA中构成最多（图4A）外显子和内含子circRNA在所有表达的circRNA中构成最多（图4B）从图4A中可以看到，作者根据邻近基因的基因组位点把筛选得到的lncRNA分为六个种类，列的灰色部分和黑色部分分别表示BCSC中上调和下调的lncRNA。图4B同理（只不过分为了5种）

此外，分析circRNA在24条染色体（22个常染色体和2条性染色体）上的分布表明，在膀胱癌细胞中表达的circRNA主要分布在chr1和chr17上（图4C）

图4：结构特征和染色体的分布情况

3、验证差异表达的mRNA，lncRNA和circRNA

为了验证之前筛选的效果，作者从差异表达基因中随机选择6种mRNA，lncRNA和circRNA，并进行in vitro验证普遍认为，在添加了特定生长因子的无血清培养基中形成悬浮液的细胞能显示出较高的干细胞特性，所以悬浮液形成培养被认为是体外富集癌干细胞的有效方法。因此，作者通过悬浮液形成培养从两个膀胱癌细胞系T24和EJ中富集了膀胱癌干细胞。通过与微阵列筛选得到的RNA的表达水平进行比较，发现差异表达趋势与微阵列分析结果一致（图5）

图5：在两个细胞系中验证差异表达的RNA

4、circRNA_103809可作为miR-511的sponge并诱导膀胱癌进展

为了进一步探究在BCSC中鉴定的差异表达非编码RNA的功能，作者选取了circRNA_103809进行研究。circRNA_103809是高度表达的环状RNA中变异最大的基因，之前的报道表明，circRNA_103809在肝细胞癌的复发中起着重要作用。在这篇文章中，作者用siRNA敲除了膀胱癌细胞的circRNA_103809，并用qRT-PCR验证了敲除效果。（图6A）结果表明，circRNA_103809的沉默显著降低了膀胱癌细胞的形成，迁移和侵袭能力（图6B–6D）

图6A：qRT-PCR分析siRNA转染EJ细胞的效率

图6B-D：敲除该RNA对癌细胞的影响

上述这些发现表明，circRNA_103809的低表达可以抑制膀胱癌的发展。接下来，为了验证circRNA_103809是否是miRNAsponge，作者用Arraystar预测了circRNA / miRNA的相互作用。预测结果显示，circRNA_103809可能与五个miRNA相互作用。为了验证circRNA_103809是否与这些miRNA结合，作者在EJ细胞系中进行了RNA pulldown实验，如图6E所示，作者首先确定了miRNA在EJ细胞系中的表达。然后使用circRNA_103809探针pull-down不同的miRNA，发现circRNA_103809在EJ细胞系中仅特异性富集了miR-511（图6F）。所有这些实验证明，circRNA_103809可以作为miR-511的sponge

图6E-F：RNA pulldown实验

5、差异表达RNA的生物学过程和通路富集

为了探究BCSCs中受差异表达的lncRNA，circRNA和mRNA影响的生物学过程，作者对lncRNA的邻近蛋白编码基因，circRNA的前体转录物和mRNA构成的基因集分别进行了通路和功能富集分析。

• GO的BP分析表明，mRNA影响的生物学过程为对化学刺激的感受，羧酸代谢过程和G蛋白偶联受体信号传导途径；lncRNA影响的生物学过程为乙醇氧化，神经支配，微管聚合的正调控，白介素7介导的信号通路和血管内皮生长因子产生的正调控；circRNA影响的生物学过程为受体循环，消化道形态发生，高尔基体内小泡介导的转运，高尔基体向质膜的转运，小泡介导的向质膜的转运。
• GO的CC分析表明，mRNA涉及的细胞组成有内质网膜，细胞质部分，囊泡，细胞周边和线粒体；lncRNA涉及的细胞组成为组蛋白脱乙酰基酶复合物，纺锤体微管和质子转运两扇区ATPase复合物；circRNA涉及的细胞组成为皮质肌动蛋白细胞骨架，特定颗粒内腔，纤毛尖端和纤毛基底。
• GO的MF分析表明，mRNA调控的分子功能为转录激活子活性，RNA聚合酶II转录调控区序列特异性DNA结合，G蛋白偶联受体活性和类固醇羟化酶活性；lncRNA调控的分子功能为醇脱氢酶活性，类固醇脱氢酶活性等；circRNA调控的分子功能为双链RNA结合和磷脂酰肌醇4,5双磷酸结合。
• KEGG通路分析的结果如图7所示

图7：KEGG分析的结果（清晰版请点击阅读原文）

6、BCSC中的LncRNA-mRNA和circRNA-mRNA共表达网络

lncRNA和circRNA的功能主要是通过与它们的靶标相互作用来实现的。与circRNA或lncRNA表达相关的mRNA可能是前者的重要靶标。所以，作者接下来就借助加权基因共表达网络分析（WGCNA）构建了差异表达的lncRNA-mRNA和circRNA-mRNA的共表达网络，从而更好地研究相关lncRNA和circRNA的预后意义。

• mRNA-circRNA的共表达网络由66个网络节点和1088个连接组成，该网络包括6个mRNA：CARHSP1，DOCK7，GFI1B，PARD6A，RAB3IL1和SPNS3可能构成了网络的核心
• mRNA-lncRNA的共表达网络由39个网络节点和380个连接组成，该网络包括13个mRNA：ADAL，BCAT1，IL19，KIAA0748，NR2E3，PRSS22，SCARB1，SMPD1，ZNF319，ALDOA，AHCY，C6orf136和LRIG1可能构成了网络的核心
• 接下来，作者借助TCGA数据库分析了这些核心mRNA的表达情况与预后生存之间的关系。结果表明，在AHCY，C6orf136和LRIG1的高表达组和低表达组之间，总生存期和无病生存期存在显著差异（图8，P <0.05）。因此，AHCY，C6orf136和LRIG1的表达水平可能是BC患者生存的预后指标。

图8：mRNA表达与总生存期和无病生存期的关系

小结

在这篇文章中，作者从三个膀胱癌标本的BCSC和BCNSC中筛选差异表达的mRNA，lncRNA和circRNA，并对筛选得到的RNA进行结构特征和染色体分布的分析，随机进行in vitro的验证。然后，作者选取circRNA_103809研究其功能并证明其是miR-511的sponge。最后，作者对得到的RNA进行通路分析，构建了相关的共表达网络，对RNA涉及的功能进行了深入研究。这些RNA的相关信号传导通路为进一步研究膀胱癌发生和进展的详细机制提供了依据，不过这篇文章也有一定不足，即应该探索RNA参与的代谢过程，特别是与药物代谢有关的那些过程，从而为阐明膀胱癌干细胞的化学耐药性机制提供思路。

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编辑：生滚粥

校审：糯米饭