核酸序列的BLAST到底该怎么做？

BLAST是在蛋白质数据库或者基因数据库中进行相似性分析的工具，全称Basic Local Alignment Search Tool，分析的结果是以统计评分的方式呈现。

那么，为什么要做BLAST呢？因为我们要看看自己设计的引物特异性到底怎么样，这直接关系到后期PCR能否顺利进行。

所以，到底该怎么操作和解读BLAST呢？

本文，小编将以“核酸序列BLAST的操作过程和结果解读”为例，做一说明。

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BLAST网址

打开浏览器输入以下网址：

https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

见到以下界面后，顺手点击Nucleotide BLAST。

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开始BLAST

点击Nucleotide BLAST，跳转至以下界面：

在Enter Query Sequence栏中输入引物序列：

(注：小编以文献报道的Col1a1引物为例，以验证该引物质量如何。文献提到的上游引物序列为5‘-GCTCCTCTTAGGGGCCACT-3’；下游引物序列为5’-ATTGGGGACCCTTAGGCCAT-3’。)

两种输入方法。第一种是简便的输入方法，即同时输入上下游引物。输入上下游引物系列都从5’-3’顺序输入。输入上游引物后，加上≥20个字母n，再输入下游引物，如下图：

第二种方法是单独输入上游或者下游序列。这里，小编选择单独输入上游序列进行操作。如下图：

下方Choose Search Set栏中的Database根据预操作基因的种属确定，本引物是小鼠的，因此选择如下。若是人类引物，可选Human genomic + transcript。

在Program Selection中：选择Somewhat similar sequences (blastn)项，如下图：

下面的参数设置很关键

点击Algorithm parameters参数设置，进入参数设置界面。

在General Parameters中：Expect thresshold期望阈值须改为1000或大于1000；在Word size的下拉框将数字改为7，其它参数默认即可。如下图：

把这些参数都设置好之后，点击Blast。等待一段时间，待页面完全稳定后得到如下结果。

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结果解读

文章开始提到，BLAST结果是以评分的方式呈现。因此解读这些评分是很重要的。最主要的是5个指标，即E值、Total Score、Identities、Gaps。

那么这几个指标在哪里看，该怎么解读呢？

E值

在Description栏，我们可以总览结果(如下图)，E值是默认按照由低到高的顺序排列。E值代表的是被比对的序列不相关的可能性，因此E值越小，代表序列相关性越大，随机匹配的可能性越低。若是E值无限趋近于0，则表示我们要检测的序列是完全匹配的，是可用的。

Total Score

同理，我们也可以在在Description栏，总览Total Score(如下图)。分值越高，代表你说检测的序列特异性越好。大家可以看到，结果也是按照分值从高到低排列的。

点击Graphic Summary，可以看到分值高、特异性较好的序列，黑线段越宽越长，点击线段可以快速进入详细该序列详细信息界面。如下图：

此外，如果你在之前同时输入两段序列进行BLAST。此时，点击Graphic Summary，可以看到分值高、特异性较好的序列之间形成连线。

图中两线段间有连线的代表这些序列与上游引物匹配、并且与下游引物互补，理论上可以扩增出基因片断。没有连线的，表示单条引物与该基因一致。

补个题外话，Alignment Scores不同颜色显示了不同得分。如果你设计的引物序列很不好，可能出现多种颜色线段。本例中，小编所用的序列是一段经典的序列，所以颜色是一致的。需要注意的是，颜色均为黑色，并不代表你的引物不好。判断引物好坏需要综合上述5个指标。

Identities

即匹配上的序列长度占中序列长度的百分数。例如点击排在最前面的序列结果进入Alignments界面，如下图。可见序列总长度为19，被匹配的有19，匹配度100%。

Gaps

即插入的或者缺失的碱基数量。一旦插入或缺失的碱基数量太多，那么必然这个引物就是不合格的。上面提到，我们的引物序列匹配度100%，自然而然，Gaps值就是0了。

最后

别忘了再看看你选定的序列结果是否为你的目标基因。