快来学学这个单基因新套路发11分顶刊

Cancer-specific mutation of GATA3 disrupts the transcriptional regulatory network governed by Estrogen Receptor alpha, FOXA1 and GATA3GATA3肿瘤特异性突变扰乱雌激素受体α，FOXA1和GATA3调控的转录调节网络

一、文章背景

类固醇激素17β-雌二醇可以激活雌激素受体（ER），而ER-α和转录因子FOXA1、GATA3在乳腺上皮细胞和乳腺癌中构成一个调节网络。其中，GATA3是乳腺癌中最常突变的基因之一，并可以特异性改变FOXA1和ER-α的染色质定位。但乳腺癌中GATA3突变如何影响ER-α在基因组的定位以及下游ER-α和FOXA1的转录网络仍未阐明。

二、分析流程

三、结果解读

1.ER-α，FOXA1和GATA3共定位与活性染色质有关

• 在无TF突变的乳腺癌细胞系T47D中研究ER-α，FOXA1，GATA3基因组定位：雌激素条件下对ER-α和FOXA1进行ChIP-seq分析，用HOMER注释峰，并进行overlap分析。（图1AB）
• 将ER-α富集峰分为4组（FDR<0.001）：EFG（ER-α+,FOXA1+,GATA3+）、EF（ER-α+,FOXA1+,GATA3−）、EG（ER-α+,FOXA1−,GATA3+）、ER alone（ER-α+,FOXA1−,GATA3−）。 约50%ER-α峰属于EFG组，约25%ER-α峰属于EF组和EG组，表明配体存在的情况下，T47D细胞中大部分ER-α与先锋因子中的一个或两个结合。（图1C）
• 用染色质开放性，增强子组蛋白标记（H3K4me1和H3K27ac）和抑制性染色质标记（H3K27me3）水平分析共定位的意义：EFG和EF组中ATAC-seq，H3K4me1和H3K27ac信号强，而EG和ER-α峰中这些活性染色质标记信号较弱。所有组中都可以检测到ATAC-seq信号，表明ER-α定位于开放染色质区域。（图1C）
• FOXA1和GATA3仅有26%和24%属于EFG组中，表明ER比FOXA1和GATA3更依赖于转录因子网络。EFG组中ATAC和活跃增强子信号最强，可能提示这些细胞在雌激素条件下增殖。（图1D）
• 对GATA3峰EFG组临近基因进行GO分析：这些基因在细胞连接，乳腺发育和生殖系统发育中显著富集，表明ER-α-FOXA1-GATA3协同结合的富集对腔细胞是必不可少的。（图1E）

图1.ER-α-FOXA1-GATA3共定位位点的染色质结构

2.GATA3突变诱导ER-α重分布

突变细胞系CR3（T47DR330fs/wild-type）表达的第二锌指结构域（ZnFn2）对GATA3共识序列（WGATAR）的识别非常重要。且大多数R330fs突变是杂合突变。

• 对GATA3突变细胞进行ChIP-seq分析并用HOMER注释，并用EdgeR注释ER-α染色质差异富集（FDR<0.05 |fold change|>1.5）：CR3细胞中ER-α峰数量减少了约1/3。与wt相比，突变细胞中约62%ER-α峰信号未改变，约20%ER-α峰信号增强，19%ER-α峰信号减弱。（图2BC）
• ER-α差异结合对染色质结构的影响：ER-α富集不变的位点K4me1、K27ac和ATAC信号变化很小；ER-α富集增多的位点ATAC和K27Ac信号也增强，K4me1信号变化很小，提示增强子活动增强；ER-α富集减少的位点K4mel和K27ac信号降低，ATAC信号轻微降低，提示部分位点失活。（图2DEF）

图2.R330fs突变诱导ER-α整体重分布

3.GATA3突变改变FOXA1染色质定位

• FOXA1 ChIP-seq分析和峰差异分析：T47D细胞和CR3细胞的FOXA1峰数目相近。CR3细胞中约80%FOXA1峰信号未改变，约9%FOXA1峰信号增强，约11%FOXA1峰信号减弱，表明FOXA1重定位频率比ER-α低。（图2AB）
• FOXA1结合位点染色质结构的变化：不被GATA3突变影响的FOXA1结合位点增强子组蛋白标记和ATAC信号也无变化。FOXA1富集显著变化的位点，ATAC信号与FOXA1结合改变呈正相关，与其作为先驱转录因子的作用一致。（图3C）增强子组蛋白标记也与FOXA1结合改变呈正相关。（图3DE）

图3.R330fs突变改变FOXA1分布及染色质结构

• 不同GATA3结合峰中ER-α和FOXA1的结合变化：GATA3峰的改变与ER-α或FOXA1结合的改变呈正相关。（图4）

图4.GATA3峰中ER-α和FOXA1的重定位

4.ER-α和FOXA1重分布改变转录活动

• GSEA分析GATA3移码突变对基因表达的影响：CR3细胞中，ER-α增强峰位点附近的基因常上调，ER-α减弱峰位点附近的基因常下调。同样，FOXA1结合的改变与基因表达改变呈正相关。（图5AB）
• 对ER-α或FOXA1相关基因的GO分析：ER-α或FOXA1降低峰的位点在腺体发育，上皮细胞发育和激素信号传导等通路富集，ER-α结合增加与细胞粘附通路有关，FOXA1增加位点在生殖系统发育相关通路中富集。（图5C）
• IPA分析上述差异表达基因的上游转录调节子：ER-α和FOXA1峰减少与配体依赖核受体如PPARG调控的级连信号网络下调有关。ER-α结合增加与AHR、CCL5等通路的激活有关。（图5DE）
• Oncomine分析研究乳腺癌中ER-α和FOXA1差异结合的临床意义：GATA3 R330fs突变中的ER-α和FOXA1基因组分布改变导致转录水平的重编码以及更具侵袭性的表型。

图5.ER-α和FOXA1重定位与差异基因表达有关

5.GATA3突变扰乱ER-α-FOXA1-GATA3网络

• CR3突变细胞中，ER-α，FOXA1和GATA3峰重叠频率降低。与wt T47D不同，约40%ER-α峰与与FOXA1和GATA3均无共定位。（图6A）
• GATA3突变细胞中，EFG峰GATA3结合显著减少，GATA3 alone峰GATA3结合增加。（图6C）EFG峰中，ER-α和FOXA1的结合、染色质开放性以及增强子标志均减少。（图6DE）这些结果说明，GATA3突变首先影响3个因子共结合的位点。
• GATA3突变对3个因子的共结合位点的影响：EFG峰中ER-α和FOXA1减少最多。（图6FG）

图6.GATA3突变扰乱ER-α-FOXA1-GATA3网络

• ER-α减少峰中，CR3细胞GATA3 ChIP信号显著减少；ER-α增加峰中，CR3细胞GATA3中等增加。同样，FOXA1减少峰中GATA3 ChIP信号也显著减少。（图7AB）这些结果表明，ER-α、FOXA1和GATA3在染色质上存在共结合。
• 分析差异结合位点的motif频率：虽然Metaplot分析中GATA3 ChIP-seq信号在ER-α和FOXA1增强峰中增强，但ER-α和FOXA1增强峰中，GATA3共同基序（WGATAR）比ER-α和FOXA1减少峰少。（图7CD）
• CR3细胞中，与FOXA1结合减少峰相比，FOXA1结合增加相关峰中ER-α motif少，FOXA motif多；与ER-α结合减少峰相比，ER-α结合增加峰中FOXA motif少，ER-α motif多。（图7E~H） motif分析结果与前面结果一致：在ER-α, FOXA1和GATA3三个motif存在的位点，ER-α和FOXA1结合减少峰富集；而在其他转录因子motif存在的位点，ER-α和FOXA1结合增加峰富集。
• EFG-peak相关基因在人乳腺癌中的表达：携带ZnFn2突变的肿瘤中，EFG相关基因表达发生改变，不携带或携带其他突变类型的肿瘤中没有这种改变，表明GATA3 ZnFn2突变影响体内ER-α-FOXA1-GATA3调控基因。（图7I）
• 这些数据共同表明，GATA3 ZnFn2突变扰乱ER-α-FOXA1-GATA3基因调节轴。

图7.motif分析：GATA3突变细胞中EF-α-FOXA1-GATA3复合体减少

小结

本篇文章中，作者研究一种GATA3突变（R330fs）对ER-α-FOXA1-GATA3调节网络中的影响。基因组分析发现R330fs突变体可以扰乱ER-α和FOXA1的定位，且这三个因子的共结合位点的富集对乳腺发育和上皮细胞生物学非常重要。且这组基因在培养的GATA3突变细胞和有相似突变的体内肿瘤中差异表达。ER-α和FOXA1在GATA3突变细胞中分布的改变与染色体结构改变有关，从而导致基因表达的改变。上述结果提示，GATA锌指2突变体在ER-α阳性乳腺癌中起到重要作用。

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