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Single-cell Proteomic Profiling Identifies Combined AXL and JAK1 Inhibition as a Novel Therapeutic Strategy for Lung Cancer

单细胞蛋白质组学分析：联合抑制的AXL和JAK1可作为一种新型的肺癌治疗策略

一.研究背景

AXL是Tyro3-AXL-Mer（TAM）受体酪氨酸激酶（RTK）的成员；在转移性肿瘤中常常高表达与耐药性和不良的生存结果相关；通过AXL二聚体或与其他RTK异源二聚体导致致癌作用，而以RTK异源二聚体以配体依赖性或非依赖性方式激活TAM激酶，用于下游致癌网络，促进癌症的形成和上皮-间质转化（EMT）

二.分析流程

三.结果解读

1.抗AXL治疗后JAK1-STAT3通路代偿性激活

• 图S1A：对原发肺癌和淋巴结中的AXL表达进行IHC分析，右图为IHC评分
• 图S1B：展示了TCGA的206例肺癌样本的AXL表达水平，右图为4个临床分期的AXL表达水平
• 图S1C：对TCGA数据进行生存分析，以Z评分> 1高表达，发现低AXL表达预后优于高表达
• 图S1DE：采用转移性肺癌细胞A549和H2009进行细胞实验，发现TP-0903（AXL激酶抑制剂）可以抑制细胞生长，且TP-0903浓度越高，对细胞生长抑制作用越强。
• 图S1F：通过shRNA沉默AXL，发现沉默后生长同样被抑制
• 图S1G：进行小鼠移植瘤实验，发现TP-0903治疗后，小鼠体内瘤重小于未治疗小鼠
• 图S2A：对TP-0903处理后和shRNA沉默后的转移性肺癌细胞进行WB验证
• 图S2B：对TP-0903处理后和shRNA沉默后的转移性肺癌细胞进行RNA测序和分析
• 图S2C：TP-0903处理和shRNA处理后上调和下调基因，其中取交集后进一步进行通路分析
• 图S2DE：对下调基因和上调基因的PANTHER通路分析，发现AXL抑制可减弱TGF-β信号通路，但JAK1-STAT3信号转通路可能由于旁路机制而被上调
• 图S2FG：上皮-间质转化（EMT）和癌症干性相关的基因在下调基因低表达细胞和上调基高表达细胞高表达
• 因此，高AXL表达与较差预后相关，抗AXL治疗后JAK1-STAT3通路代偿性激活

图S1. AXL在肺癌细胞系、原发性肿瘤和异种移植物中表达

图S2. TP-0903处理后肺癌细胞的变化

2.转移性癌细胞中AXL和JAK1的有效靶点

• 图1A：CyTOF分析流程，作者选用了21中包含：AXL、JAK1-STAT3和TGF-β的致癌信号；癌症干性的标记；EMT的CyTOF抗体对患者来源的肿瘤和体外实验的肿瘤细胞和的进行亚群分析。
• 图1B：根据免疫、基质和内皮细胞的标记物CD45- / CK8 + / 18 + / EpCAM +谱图鉴定肿瘤上皮细胞（质量控制）
• 图1C：对CD45- / CK8 + / 18 + / EPCAM +进行进行聚类，得到27个亚群
• 图1D-G：展示聚类后细胞亚群的致癌信号、癌干和EMT标记表达水平
• 图1H-L：选择其中某一个来源的患者进行聚类和致癌信号、癌干和EMT标记表达水平分析，发现不同细胞簇表达不同

图1. CyTOF实验

• 图2A：对体外实验的细胞进行聚类分析
• 图2B：细胞系A549的CyTOF数据分析，发现A549中有高AXL表达亚群（亚群9），而经过TP-0903处理后，有了3个新亚群（6、7、8）其中亚群6、7也有高AXL表达，而亚群8则低AXL表达；同时在亚群6-8中有高JAK1-STAT3信号表达，因此验证了RNA-seq的结果，有可能是JAK1-STAT3通路激活导致耐药性。另外，TP-0903处理后，pSTAT3、SMAD2水平增加，而SMAD4水平降低
• 图2C：细胞系H2009的CyTOF数据分析，TP-0903处理后AXL和SMAD4的表达降低，而JAK1信号同样增强。
• 图2D：联合TP-0903与ruxolitinib（JAK抑制剂）治疗，发现加入ruxolitinib后，TP-0903治疗效果更佳明显
• 因此，这种对转移性细胞系的CyTOF分析确定了JAK1-STAT3的信号传导，该信号传导既可以起AXL被抑制后进行外源诱导AXL的作用，也可以作为细胞存活和侵袭的旁路机制存在；同时联合疗法可能有效抑制AXL和JAK1-STAT3高表达的肺癌细胞。

图2. TP-0903处理后的肺癌细胞CyTOF分析

3.高AXL表达亚群中JAK1-STAT3和TGF-β的增加

• 图3A：根据AXL水平把细胞亚群由低到高分成4大类，并展示JAK（JAK1和pSTAT3）和TGF-β（SMAD2，SMAD4和TGFBRII）的表达
• 图3B：展示了亚群的大小
• 图3C：通过小提琴图展示图3A每一大类中JAK和TGF-β含量，其中（1）AXL、JAK1和TGF-β信号传导成分的低表达；（2）AXL的中表达和JAK1和TGF-β信号高表达；（3）AXL和TGF-β的高表达和JAK1信号中表达；（4）包括AXL在内的所有五个信号传导成分的高表达、
• 图3D：展示了各个来源的细胞的分类情况，其中来源细胞系的异质性低于来源于肺肿瘤。
• 因此，AXL水平最高的大类，绝大多数细胞显示出AXL、JAK1和TGF-β信号传导的同时上调。

图3. AXL表达分型

4.高AXL亚群中癌症干性和EMT增加

• 作者进一步分析CyTOF数据中的癌症干性标记：OCT3 / 4、NANOG、CD133，CD44和ALDH1A1
• 图4AB：通过热图和小提琴图展示了它们的表达，其中在第三、四大类中，癌干标记高表达。
• 图4C：展示TP-0903治疗后，癌干标记的表达情况，发现治疗后CD133明显高表达，因此可能是导致耐药的原因。
• 图4D：展示了早期与晚期的癌症干性标记发现CD33在晚期中普遍高表达，而在早期中部分高表达，因此，说明部分高表达早期肿瘤的侵袭力强

图4. AXL亚群与癌干性的关系

• 由于CD133表达增加是EMT的经典标志性标记，因此作者进一步探究EMT标记（SNAIL、TWIST、波形蛋白、N-钙黏着蛋白、纤连蛋白、β-连环蛋白、ZO2、PECAM、EPCAM和CK8 / 18）的情况。
• 图5A：展示EMT标记表达情况，间质标志物的水平与高AXL水平对应，而上皮标志物在II类和IV类中表达最高
• 图5B：根据Eindex和Mindex，展示了4个大类的EMT情况，发现IV类显示EMT的Eindex和Mindex显著高于其他三类。
• 图5C：展示了TP 0903治疗使这些亚群的Eindex和Mindex更高。
• 图5DEF：作者应用AFM（Atomic force microscopy ）来检测TP-0903处理和未处理的细胞刚度、变形和粘附。TP-0903处理的细胞变得更偏向上皮，具有增加的刚度和附着力以及减弱的变形能力。
• 图5GH：针对患者进行了Eindex和Mindex分析，发现晚期患者有较高的Eindex和Mindex，而在早期Pt 007和Pt 016患者中也有，说明这两位患者的肿瘤具有侵略性。

图5. AXL亚群与EMT的关系

5.肺肿瘤的多样进展和消退模式

作者对患者来源的肿瘤细胞进行伪时间分析：图6A 线性模式，有6位患者由I类到IV类过渡。患者Pt014则从II类过渡到IV类，患者Pt 010从类别I直接过渡到类别IV，说明更具侵袭力；而Pt 004和016从III到II再到IV说明III / II中间态的不稳定；图6B：非线性模式，有两位患者缺乏中间阶段；图6C：punctuated regression 模式，肿瘤亚群由高风险转变低风险类别。

6.在类器官中预测AXL和JAK1

• 图6D-F：建立类器官，有I / II类肿瘤细胞亚群采用Pt 008和010建立PDO，而Pt 014和017的PDO属于II类；Pt 016属于IV类
• 图6G：在类器官中进行AXL和/或JAK抑制剂实验，发现不同类型的肿瘤治疗效果不同，可以通过肺肿瘤的CyTOF分析提供个性化治疗

图6. 伪时间分析与类器官

四. 小彩蛋

目前市面上35个左右marker genes的cyTOF panel，如果是公司最常用的免疫相关基因的，也就是说目标是用来做免疫细胞图谱的，价格也就在5k左右；如果做一个3vs3的，成本也就在3w左右！一个样本的通量超过10w个细胞，这是非常不错的一个思路。送给关注科研菌的小伙伴们。此外，因为cyTOF是基于蛋白的，所以样本没有scRNAseq的样本那么容易降解；缺点就是基因数目有限，建议大家可以结合bulk RNAseq的数据进行综合分析。实在是没钱，您也可以考虑一下通过公开数据集中的cyTOF数据进行挖掘。

小结

作者采用CyTOF方法基于AXL信号作为潜在的靶点对肺癌进行了分类得到4不同的亚型。通过转录组学研究证明了TP-0903（AXL激酶抑制剂）对转移性肺癌细胞的致癌通路的影响。CyTOF分析显示，TP-0903可抑制SMAD4 /TGF-β信号并诱导JAK1-STAT3信号进而代偿AXL的缺失。高AXL、TGFβ和JAK1信号在晚期患者中有CD133介导的肿瘤干性特征和混合EMT特征，提示与远处转移有关。伪时间分析发现了四个不同类别之间的细胞进程且与每个患者的临床病理特征相关。通过对高AXL和JAK1的肿瘤中获得的患者类器官（PDO）进行TP-0903和ruxolitinib（JAK抑制剂）实验，发现对治疗敏感验证了CyTOF得到的结论。

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