scRNA_seq:单细胞转录组测序简介

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在传统的测序技术中，上机测序的样本是由多个细胞构成的，最后分析得出的结论也只是基于所有细胞的平均水平，但是我们知道细胞是具有异质性的，对于大脑等复杂组织而言，其细胞类型是多样的；对于肿瘤细胞而言，其细胞异质性更是尤为突出，为了克服细胞异质性的影响，提高科学研究的精度，科学家在不断尝试，希望从单个细胞的水平去进行测序分析。

从2009年开始，各种单细胞技术不断出现，最初由于其通量低，操作繁琐，价格高等一系列因素，导致其应用并不广泛，近年来随着技术的不断发展，通量在不断提升，价格也在不断下降，单细胞测序技术越来越成熟，出现了很多成熟的平台，比如本文要介绍的10X Genomics。

单细胞测序的应用领域非常多，比如CNV检测，ATAC_seq等, 其中引起广泛关注的，就是单细胞在转录组学的应用，即single cell RNA sequencing, 简称scRNA-seq。官方提供的流程如下

10X Genomics公司也为之提供了一系列配套的仪器和软件，最核心的就是分离细胞，制备文库的机器，叫做Chromium Controller, 图片如下

核心是通过构建GEM体系来实现单个细胞的分离，基本结构如下所示，呈现出一个双十字的结构

首先是Gel Beads，其中包含了几十万个bead, 类似探针，用于捕获细胞中的特定序列，结构如下所示

由4个组成部分，第一段叫做read1, 其实就是adapter序列，用于后续的上机测序，第二段是barcode, 长度为16bp, 用于区分不同的细胞，第三段是UMI, 用于区分不用的转录本序列，长度为12bp, 第四段在不同的试剂盒中对应不同的序列，但是作用是相同的，都是用于捕获目的序列，对于转录组测序而言，就是一个30bp的ployT结构，用户捕获有ployA尾的转录本。

1个Gel在通过第一个通道时，会加入一个细胞和后续反应所需的酶，然后通过第二层通道，第二层通道就是一层油，通过之后，就会形成一个油滴包裹的细胞和酶的混合物，就是一个GEM。

后续的文库制备示意如下，对于每个单独的GEM, 其包含的beads用于捕获该细胞中的转录本序列，然后进行反转录，PCR扩增等过程

最后通过酶切，末端修饰等过程，构建一个可以用于illumina上机测序的文库

该文库的片段构成如下

Read1和Read2就是Truseq的两个adapter序列，中间的灰色横线就是实际能够检测到的转录本序列，对于150bp的读长而言，这段序列的长度为91bp。

本文重点介绍了10X genomic的单细胞转录组文库的构建过程，后续会进行相关分析的介绍。

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