单细胞测序揭露小细胞肺癌化疗后瘤内异质性

单细胞转录组分析综述

单细胞入门-读一篇scRNA-seq综述

文章信息

● 题目：Single-cell analyses reveal increased intratumoral heterogeneity after the onset of therapy resistance in small-cell lung cancer ● 发表日期：2020年2月17日 ● 杂志：Nature Cancer ● DOI：https:/ / doi.org/10.1038/ s43018-019-0020-z

摘 要

小细胞肺癌(small-cell lung cancer，SCLC)常常表现为化疗敏感到化疗耐药的快速演变，由于复发后组织样本的稀缺，这种转变的机制仍然不清楚。作者从 SCLC患者体内分离出循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell ,CTC），以此构建CDX模型 (CTC-derived xenograft, CDX)，然后通过对患者CTC，以及化疗耐药和化疗敏感患者CDX模型进行单细胞测序，以阐释SCLC瘤内异质性（ intratumoral heterogeneity, ITH）。从中，其发现化疗耐药的细胞群体ITH普遍性增加，包括治疗靶点和潜在耐药途径的异质性表达。同样，直接从血液中提取患者CTC进行分析证实复发后ITH增加。这些发现表明，SCLC耐药的特点是细胞亚群之间的基因异质性的表达，导致肿瘤出现多重并发的耐药。这些发现强调了临床上需要对初发的SCLC进行合理的联合治疗，以最大限度地提高初始治疗效果，抑制ITH及多重耐药的出现。

样本处理

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样本选择

化疗敏感性

MDA-SC39, MDA-SC68 , HCI-008, MDA-SC4化疗敏感；

MDA-SC16,MDA-SC49,MDA-SC55,MDA-SC75化疗不敏感。

一共构建了8个CDX模型

其中MDA-SC4、MDA-SC68 又构建了CDX耐药模型

单细胞测序取样点CDX传代次数：

MDA-SC4s: P3; MDA-SC16r: P3; MDA-SC39s: P2; MDA-SC49r: P2;

MDA-SC55r: P1; MDA-SC68s: P2; MDA-SC75r: P1; HCI-008: P3.

患者CTC取样：

MDA-SC55三个时间点: diagnosis, responding, relapsed;

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流程图

所有单细胞及bulk样本数据储存在GSE138474中

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数据产生及初步处理

• 10x 测序平台v2试剂盒，HiSeq 4000 (Illumina)测序
• 过滤、总细胞数量：CDX模型 Cells with fewer than 3,000 expressed genes and genes expressed in <10% cells were filtered out. The total numbers of cells in each model after filtering were as follows: MDA-SC4s: 8,998; MDA-SC16r: 7,173; MDA-SC39s: 2,053; MDA-SC49r: 2,593; MDA-SC55r: 2,853; MDA-SC68s: 2,779; MDA-SC75r: 3,959; HCI-008: 5,233. Each CDX model was downsampled to 2,000 for inter-model comparison. 单独CTCs测序数据：CTCs with fewer than 50 expressed genes and genes that were expressed in <1% cells were also filtered out.After filtering, the treatment-naïve, treatment responding and treatment relapsed samples had 637, 1,108 and 974 cells remaining, with the numbers of genes expressed ranging from 50–2,153.
• 初步处理：Seurat V2.3流程： Normalize data Scale Data(regress out G2/M and S phase cell cycle gene scores) PCA(based on highly variable genes) Elbowplot选dims 降维-RUNTSNE(default perplexity value of 30) 数据分析思路

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CDX数据样本聚类及常见肿瘤相关marker展示

同一样本内肿瘤marker表达不一致如MDA-SC49r里MYC、EMTscores表达不一致，体现了瘤内异质性的存在。

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CDX模型之间baseline ITH计算

• 选取前20个PC，计算细胞之间的平均Euclidean distance来计算ITH score。（对应图a）
• 通过dispersion of gene expression来衡量ITH：使用所有基因的normalized后的表达量，通过EdgeR包的estimateDisp()计算。（对应图b）

• 基于tSNE，计算每个样本的 the optimum number of clusters(cluster 包 Silhouette score 最大值时)，可发现铂耐药组细胞cluster较多，有明显异质性。

• 差异表达基因表明铂敏感和耐铂CDX之间差异表达的基因只在单个CDX中检测到，而不是存在于在两个或更多耐药模型中。

• GSEA分析揭示CDX模型各个cluster显著富集的通路，提示即使在一个肿瘤内部也有多个耐药相关信号通路共表达。

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CDX模型内部各cluster之间存在基因差异表达

运用heatmap和violinplot展示与SCLC治疗和耐药相关的基因在一个样本内部的各cluster间存在差异表达（如PARP1, CHEK1, AURKA, AURKB, DLL3, VIM, 及EMT scores等）。

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患者CTCs单细胞测序

分别从diagnosis, responding, relapsed三个时间点手机患者MDA-SC55血液中的CTC进行测序，质控降维聚类后发现两个cluster是CTCs。

提出CTCs，重新降维聚类，可得到5个不同的cluster，其中cluster1主要来自diagnosis时间点的CTC。

分别计算diagnosis时的CTC及relapsed时间点的CTC及CDX模型的ITH评分，发现relapsed时间点ITH评分更高。relapsed时间点CTC及CDX模型SCLC转移及耐药相关基因表达有所不同。

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CDX模型模拟患者化疗耐药过程

对MDA-SC68s CDX模型分别进行对照及cisplatin处理，当肿瘤体积增至1000mm3后取肿瘤进行单细胞测序。图c可看出对照组及cisplatin耐药复发组肿瘤细胞几乎无混合。

与对照组相比，cisplatin-treated CDX ITH score增高

与对照组比，cisplatin-treated CDX里 ASCL1明显下调，与药物耐药显著相关。cluster3 EMT score升高, DLL3特异性降低。提示在MDA-SC68s中，经过铂处理后，间充质细胞取代了对铂相对敏感的ASCL1阳性细胞。

作者接着用SCLC的靶向治疗药物PARPi及CHKi进行了如上述类似的实验及分析，提出PARPi与CHKi耐药机制可能不同。

临床意义

• 构建了可模拟SCLC疾病进展及转移的CDX模型；
• 化疗耐药后肿瘤异质性增加。同一肿瘤内部存在转录异质性，体现多种共存的耐药机制。提示SCLC在治疗初期应采用联合化疗方法。
• CTCs转录谱在同一病人不同时间段存在异质性表达，提示可通过病人病程中连续取样，从而捕捉患者治疗靶点表达的动态变化。