眼看2019年就快过完了,老板交给你的标书完成了吗?实验方案搞定了吗?
RNA也分为很多种了,像miRNA、mRNA、lncRNA、circRNA等,前面也有蛮多的文章介绍过了,咱们今天主要介绍mRNA的研究路线。
mRNA的研究也分细胞外和细胞内,细胞外的研究技术很多,咱们今天了解一下mRNA的细胞内研究技术和策略:转录、成熟、出核、翻译、降解。
mRNA的一生其实很短暂,从基因转录开始,到RNA前体分子加工成熟,出核到胞质中,在核糖体中翻译成蛋白,然后被RNase降解,完成了使命。
(1)硬技术介绍
1. 细胞固定后mRNA胞内显影
技术:smFISH、branched DNA FISH、Sequential hybridization smFISH
单分子荧光原位杂交(smFISH)
普通FISH只能定性,而定量版本就是smFISH,它是一种新的RNA定量分析方法,能报告转录本丰度和空间定位,。
Branched DNA FISH
这个技术就是设计一些一级DNA探针的二级探针,加强荧光信号
MERFISH
MERFISH是一个高度多重化的smFISH成像方法,可以在单个细胞中鉴定数千种RNA的拷贝数和空间定位。该技术使用组合标签、连续成像等技术来提高检测通量,可谓高逼格的FISH技术。
2. 活细胞RNA胞内显影
活细胞中RNA要实时观测,这里面也需要进行荧光显色,和“固定”状态的细胞内RNA观测不同,活细胞状态下不能影响RNA的翻译,所以探针需要针对非翻译区。
Molecular beacons
这种设计是很聪明的,首先合成互补的DNA探针,然后一端加载荧光基团,另外一端加载淬灭剂,而DNA探针末端有2、4个碱基互补,这样在天然状态下,该探针是没有荧光的,只有探针和RNA结合后,才会发光显影。
Spinach-like aptamers、Stem-loop labeling
这两种技术都采用发光基团(荧光素)和探针分开的策略,先让探针渗透到细胞中结合,然后加荧光素进去结合,最后发光的条件性发光的策略,一般设计探针时放在非翻译区。
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