寻觅肿瘤蛛丝马迹，液体活检未来可期--CTC

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肿瘤常规组织活检因创伤大，取样困难，窗口期，无法反应异质性和肿瘤全貌等因素，使得临床中的应用受到限制。液体活检是对血液、胸水、腹水、脑脊液唾液、尿液等体液检查，不仅具有微创、快速、敏感和准确等优点，还能反应肿瘤的基因组全貌，是精准诊断和判断预后的有效方法。

液体活检被评为 2015年 MIT 十大科技突破之一， 自 2011 年以来每年相关领域的文章数量呈指数增长。各大国际制药巨头也积极地关注与推动， 使得液体活检离临床应用越来越近。液体活检主要有 3 个检测对象：循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）、循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和外泌体（Exosome)。本文详细介绍循环肿瘤细胞CTC，后续进行ctDNA和外泌体的介绍。

名词解释

循环肿瘤细胞 (CTC)：是指从原发灶或转移灶进入血液循环的肿瘤细胞，是外周血中各类型肿瘤细胞的统称。肿瘤早期转移理论认为，肿瘤细胞未获得恶性表型之前就可脱离原发灶，它的播散可能存在于肿瘤发生发展的全过程，这些早期播散平行独立于原发灶进行进化，是恶性肿瘤患者出现术后复发和远处转移的重要原因，也是导致肿瘤患者死亡的重要因素。

1869 年，CTC 首次于乳腺癌患者的血液样本中被发现 。直到2007 年，CTC 才被美国临床肿瘤协会列为肿瘤标志物。肿瘤不仅具有时间和空间的异质性，治疗的选择性压力也会诱导基因型改变，因此，最好的取材应该是正当下的肿瘤组织或细胞，但有时获取肿瘤组织非常困难，CTC 正好能够弥补难以动态获取肿瘤组织的不足。

检测技术

CTC 外周血中的浓度非常低且外貌形态不典型，体积大小不一，内在特征也具有极大的异质性，比如上皮间质转化导致细胞表面抗原标志物差异化，携带不同的分子信息，并具有不同的转移潜力，可以说没有两个完全相同的癌细胞。因此需要根据其特性首先将其分离富集， 再对富集到的细胞进行鉴定识别。

目前，大多基于肿瘤细胞表面的分子标志物或者 CTC 的大小、密度、电荷情况等特性对CTC 进行富集， 然后通过细胞化学染色、荧光原位杂交技术 、聚合酶链式反应、测序等技术对其鉴定 。

建立在免疫亲和原理上的 CTC 富集方法较为常用，它是利用特异性抗体与细胞表面抗原进行特异性结合来富集 CTC。由于 CTC 富集纯度有限，且CTC的数目和表面标志物也在变化，通过对CTC 表面标志物检测，能够反映肿瘤发生发展的动态变化，并能很好地指导临床治疗。例如，Cellsearch 技术利用免疫荧光化学染色鉴定 CTC，当形态学特征中包括肿瘤细 胞 特 征 并 显 示 出 EpCAM + /CK + /DAPI + /CD45-时判定为CTC。

核酸检测法和免疫细胞化学术可能存在假阳性和假阴性结果， 无法确保其识别鉴定结果的准确可靠。流式细胞术通过测定细胞的存活状态、内外标记物等多个重要参数， 从各方面保证了CTCs 鉴定结果的准确率， 可靠性高。DEPArray 系统除了多通道扫描细胞影像保证结果准确率之外，以温和的方式精准识别捕获单个目的细胞， 有助于后续精确的分子分析验证， 进一步保证了结果的可靠性。

随着机器视觉、图像处理技术的往更深度和广度不断发展， 图像式流式细胞仪和基于表征性图像识别技术将成为 CTCs 识别检测领域今后发展的新趋势。

临床应用

早期筛查：在无任何临床症状或肿瘤恶变的极早期，肿瘤细胞就可在血液循环中播散定植，乃至300 μm大小肿瘤结节形成时即可在外周血检测到 CTC 。在慢阻肺患者中 CTC 可较低剂量的 CT 检查提早 4～5 年发现肺癌患者 。CTC 有望成为肿瘤早期筛查或监测微转移灶的指标。

复发转移和预后判断：术前术后CTC≥ 5个/7.5 mL外周血的胃癌患者 3 年无进展生存期和总生存期明显短于 CTC＜5个/7.5 mL 外周血的患者，术后 CTC 增加也提示胃癌患者复发转移。46 例非小细胞肺癌患者治疗前后观察，CTC＜8 个 /3.2mL 外周血组和CTC≥8个/3.2mL 外周血组的总生存期和无进展生存期有显著性差异 。一项纳入 5 000 例乳腺癌患者的 III 期临床试验发现，CTC 阳性者的复发风险比阴性者高 13倍。CTC 检测或可对患者进行危险分层分级，筛选高风险复发转移人群，或使其从提早干预治疗中生存获益。

疗效监测：一项6 000多例转移性去势抵抗性前列腺癌患者的Ⅲ期临床试验验，分析了每例患者8种不同的反应终点，结果发现，CTC0( 基线 CTC≥1；13 周后 CTC = 0) 和 CTC 转变组( 基线 CTC≥5；13 周后 CTC≤4) 均可以用于评估用药早期的临床疗效， 且均比临床常用的前列腺特异性抗原PSA准确。也有研究利用微流控结合RNA基础的液滴数字定量PCR技术发现，纵向测量CTC评分能够预测恶性黑色素瘤患者早期应用 PD-1治疗的反应。显示出CTC在疗效和耐药机制方面具有潜在的临床应用价值。

辅助分期：美国癌症联合委员会 在 2010 年制定的《肿瘤分期指南》，首次把CTC列入TNM 分期系统，作为一个新的远端转移标准，列为 cM0( i + ) 分期，出现在 M0 和 M1 之间。2018年1月1日在全球启用的 AJCC 第8 版癌症分期系统中，除保留 cM0( i + ) 分期外，更进一步明确了 CTC 检测的临床价值。最新指南将CTC 列为继ER/PR、HER2、Ki67 和肿瘤组织学分级4 项生物学指标之后的又一项乳腺癌预后评估工具，认为乳腺癌外周血中存在 CTC， 提示预后不良。

CTC 对肿瘤远端转移和预后的评估作用已得到国际权威肿瘤诊疗指南的肯定， 从传统的宏观解剖学分期， 到结合基因检测分析肿瘤生物学信息， 推动了临床肿瘤学综合预后评价体系从量变到质变的升华。

存在的问题

CTC 检测技术繁多，功能各异 ，临床上难以快速而准确的选择与患者肿瘤类型和病情期相匹配的技术。

在使用 CTC 计数评价患者生存期时， 其cut-off 值在不同肿瘤中不同， 在同一肿瘤中亦无定论。

CTC 的异质性及脱落入血在时间上的随机性， 很难保证任何时间点的CTC 数目均与患者的疾病情况具有一致， 难以确定CTC 的临界值或根据某次的检测结果得出明确结论。

参考文献：

陈丽婷, 周剑峰: 液体活检在肿瘤临床精准诊断和预后判断中的应用.内科急危重症杂志 2017, 23:99-101.

崔巍, 张玉娟: 循环肿瘤细胞检测的现状与挑战.山东大学学报(医学版) 2018, 56:40-45.

王燕, 徐秀林: 循环肿瘤细胞识别技术研究现状.生物信息学 2018, 16:137-142.

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