细胞侵袭实验

一、编辑实验程序

打开 RTCA software， 可看到三个用户权限 ID，本次实验我们用 administrator 登录，密码为小写的 administrator。user one 和 user two 登录时无需密码。点击确认后，可根据实验需求进行选择适当的 cradle。

启动 RTCA DP 软件后，如果软件仍停留在上一个实验界面，可以在 file 中点击 release，开启一个新的实验。experiment note 页面下，填写本次实验的相关信息，包括实验名称，所使用细胞板的 ID number 信息等，备注栏内填写一些简单的实验设计。到 Layout 页面下，输入本次实验的设置，选中 A1-H1，填写细胞系名称，细胞类型是 HT-1080，每孔 20000 个细胞，点击 apply，设置信息完成。选择 A1-F1，本实验将从高到低浓度 Matrigel 进行包被，最高浓度为 10%，以 2 倍稀释度稀释，两个重复。选择 G1 和 H1，填写 serum Free Medium 作为空白对照,保存后，将 A1-H1信息复制到第二排。此时可见 16 孔板设置完成的实验信息。转到 schedule 页面，点击增加一步按钮。第一步是用于检测背景值的实验步骤， step-status显示为 IDLE，表示未完成，请勿更改背景检测步骤参数。点击增加步骤按钮，建立第二个实验步骤，这里根据检测时间的长短，可以自行设计实验的检测次数及间隔时间。

二、准备实验以及包被

从冰箱中取出 Assembling tool 以及 CIM plate 上板。拆开上板，可见板上和盖子上均有蓝点标记，将蓝点对蓝点，把板放在 Assembling tool 上。由于 CIM plate 板的电极是铺在孔膜的背部，所以上板不能直接接触桌面，安装时需特别注意。首先进行 Matrigel 包被，每孔内加入 50 µl matrigel ，每做完一个梯度，即 4 个孔后，马上从孔内轻轻吸出 30µl Matrigel。如果出现气泡，用枪头小心剔除。空白对照的四个孔同样加入 50µl 的无血清培养基，然后吸出 30µl。盖上盖子，将整个 Assambling tool 连同板子 ，放入培养箱中孵育 4-5 小时，使 Matrigel凝结。

三、组装 RTCA CIM Plate-16 以及测量 CI 背景值

取出 CIM plate 下板，蓝点对蓝点方向，放在 Assambling tool 第二个槽内，下板中加入160µl 预温好的完全培养基，动作缓慢且在最后轻抬枪头，可见整个液面形成漂亮的弧形。将 CIM-Plate 16 Assembly Tool 旋转 90 度，小心不要干扰液面将上板拿起，水平移到下板上方，快速用力扣下，中间不能有停顿，听到卡卡两声，表明上板和下板安装完成。检查安装是否紧扣在一起。在上板中每孔加入 30 µl 无血清培养基， 盖上上板盖子将整块 CIM-Plate 16 放入 RTCA DP 分析仪。放在培养箱中平衡一个小时。一小时后， 进入 schedule 页面，选中第一步，点击开始按钮。背景值测完后，显示 ready for starting next step.回到 Message 页面，看是否有任何报错信息。

四、准备细胞，并加入 RTCA CIM Plate-16 上腔

取出 CIM plate， 重新放回到超净台中的 Assambling tool 上，每孔加入 100 微升含 20000个细胞的细胞悬液。细胞准备参照本光盘的细胞传代及其他视频的相关操作，重悬 HT-1080细胞。为了避免培养箱内由于温差产生蒸腾作用而引起边缘效应，将 CIM 培养板，在常温下静置半个小时。

五、运行实验

将 CIM plate 重新放回 RTCA DP 分析仪上，看到提示 plate scanned, connection is OK 后，点击开始第二步。这时机器开始每 15 分钟检测一次孔内细胞的迁移的情况。

六、实验结果分析

在 Cell Plot 页面，选择显示平均值以及标准差， 点击 add ,可见不同组得到的实验信号。如图所示，当 Matrigel 浓度最大时，细胞侵袭越困难，而无血清培养基对照孔内，细胞侵袭的信号就非常明显。根据包被 Matrigel 的浓度由高到低，细胞侵袭能力逐渐增强。

七、注意事项

1、 CIM-Plate 16 不能重复使用：

CIM-Plate 板上可能会有细胞或包被试剂的残留，影响再次实验的结果可靠性及重复性。

2、健康的细胞培养物：

健康的细胞侵袭效率较高，此外，较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。实验细胞必须在前一天进行细胞传代，并保证消化时细胞融合达 60%-80%

3、 Matrigel 使用要求：

由于 Matrigel 非常容易在常温下凝结成胶状而无法使用，要将 Matrigel 置于冰上。侵袭实验前一天，需要将所需的 Matrigel 从-80 度取出，放在 4 度保存，使其溶解成液状，另外，所有需要接触 Matrigel 的耗材，包括枪头，移液管， CIM plate 上板等需预先放在冰箱-20或者 4 度预冷。

4、无血清培养基制备细胞悬液：

制备细胞悬液前可先让细胞去血清饥饿 12－24h，进一步去除上板中血清的影响，若上层中含血清，下层培养液的趋化作用就会减弱甚至消失了，影响实验的进行。